ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

В распространении РВ существенную роль могут играть собаки, кошки и даже дикие жвачные, например краснохвостые олени. Концентрация вируса в фекалиях может достигать Ю10-Ю12 частиц/мл. В персистенции РВ в стаде важное значение имеет повторное инфицирование взрослых животных от телят (4, 5).

Основной путь заражения - алиментарный. Передача осуществляется путем прямого контакта, а также через инфицированные предметы ухода. Считают, что возможно внутриутробное заражение плода в результате проникновения вируса через плаценту. Одиако, по другим данным, наоборот, РВ не проникает через плаценту, тогда как иммуноглобулины пассивно передаются через нее.

Спектр патогенности в естественных условиях. РВ, выделенные от телят, патогенны и для поросят. Была воспроизведена диарея у телят-гнотобиотов путем заражения их РВ человека. О спектре патогенности РВ КРС можно косвенно судить по выявлению ВНА у различных видов животных. Так, например, из 288 сывороток, взятых в разных районах Японии в 1975-77 гг., исследованных на наличие ВНА к шт. Линкольн РВ, в титре 1:2 или выше АТ к бычьему РВ были найдены у всех видов животных.

ДИАГНОСТИКА

На основании эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных ставят лишь предварительный диагноз, окончательный устанавливают лишь лабораторными методами. Последние базируются на обнаружении вируса или вирусного АГ в фекалиях больных телят, содержимом кишечника, клетках слизистой оболочки тонкого кишечника

Глава 1. Family Reoviridae Реовирусные инфекции павших и вынужденно убитых животных, а также на выявлении АТ к РВ в сыворотках крови больных и переболевших телят и в сыворотках крови и молозиве коров-матерей.

Экспресс-методы диагностики. Разработана тест-система ИФА иа основе РВ свиней при выявлении специфического АГ РВ КРС, которая обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Её целесообразно применять в лабораторных условиях для экспресс- диагностики. Поскольку полипептид VP5 содержит перекрестный групповой АГ, локализованный в консервативном домене, который является общим для всех РВ группы А (2а). Показана возможность индикации рота- и коронавирусов методом флюоресцентных зондов и АТ к ним. Он основан на регистрации ранних этапов взаимодействия вирусов с рецепторами клеток (1а).

Выделение вируса. В лабораторию для исследования направляют не менее 10 проб жидких фекалий, тонкий кишечник с содержимым (не позднее 2-3 ч с момента гибели или вынужденного убоя телят), 10-15 проб парных сывороток больных и переболевших животных, 6-10 проб сыворотки крови коров и 6-10 проб молозива. С наибольшим постоянством вирус удается обнаружить в пробах фекалий, взятых в первые дни болезни, поэтому для исследования пригодны фекалии, взятые от 2-14-дн телят с клиническими признаками диареи на 1-3-й день болезни. Сразу же после доставки в лабораторию пробы обрабатывают или хранят при 4°С не более суток, при -20-50°С до 1 мес. Сыворотки крови хранят при 4-10°С не более 1 нед, при -20°С до 1 мес; молозиво - при 4°С не более 2 сут, при -20°С - до 1 мес.

тыс. об/мин, надосадочную жидкость переносят в стерильный флакон, добавляют пенициллин и стрептомицин (по 1000 ЕД/мл), выдерживают 10-12 ч (ночь) при 4°С и исследуют.

Выделение РВ в культуре клеток. Показана корреляция между заболеванием новорожденных телят диареей с присутствием РВ АГ в фекалиях. Следует иметь в виду, что обычными методами вирус не культивируется, а применение дополнительных воздействий - химических (трипсин) и физических (центрифугирование вируса на слое клеток) - дает положительные результаты при высоких концентрациях вируса в фекалиях, что проверяется электронной микроскопией. Для этого содержимое одной пробирки после замораживания и оттаивания и обработки полиэтиленгликолем ресуспендируют в 0,1 мл дистиллированной воды и исследуют в электронном микроскопе. В положительном случае обнаруживают типичные частицы РВ и их скопления. Специфический характер частиц подтверждают методом иммуноэлектрон ной микроскопии.

Индикация и идентификация вируса

ЭМ и ИЭМ. Метод электронной микроскопии (ЭМ) суспензии вируса из жидкой части фекалий наиболее широко применяется для диагностики инфекции при концентрации вируса в фекалиях не ниже 104-105 частиц/мл жидкости. Препараты готовят из осветленной низким центрифугированием жидкой части фекалий. Однако лучшие препараты получают при разведении фекалий дистиллированной водой 1:1-1:10 и последующем осветлении суспензии центрифугированием при 4-10 тыс. об/мин в течение 15 мин. Простой метод приготовления препаратов из фекалий, не уступающий по чувствительности ультрацентрифугированию, состоит в следующем. К 4 мл осветленной низким центрифугированием жидкой части фекалий добавляют 60% насыщенного р-ра (NH^SO^ смешивают, оставляют на 1 ч при 4°С, а затем центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в 4-х каплях дистиллированной воды и готовят препараты. Существуют различные способы и модификации приготовления препаратов из. Наиболее широко используется капельный способ.

Более целесообразно применять ИЭМ. Для этого можно использовать сыворотку лабораторных животных (кроликов, морских свинок), иммунизированных РВ обезьян (SA 11),

Глава 1. Family Reoviridae Реовирусные инфекции или сыворотку реконвалесцентов. Содержание и специфичность АТ в сыворотках реконва- лесцентов могут быть проверены в серологических реакциях с использованием вируса SA 11.

При обработке фекальной суспензии иммунной сывороткой одновременно с обнаружением типичных частиц РВ устанавливается их специфичность, на что указывает выявление агрегатов, в которых РВ частицы связаны специфическими иммунными глобулинами. Чаще используют три модификации иммуноэлектрониой микроскопии (4).

При положительном результате РВ частицы выявляются в препаратах в виде специфических скоплений (иммунных комплексов). Оценку специфичности реакции проводят путем подсчета числа и размеров подобных скоплений, а также по степени покрытия отдельных вирионов АТ сыворотки. Выраженность этого эффекта при определенном навыке можно оценивать по шкале условных единиц от 0 до 4-х плюсов.

ИФ. Для обнаружения вирусного АГ в замороженных срезах тонкого кишечника, мазках фекалий и культуре клеток успешно применяют прямой и непрямой методы. При исследовании криосрезов кишечника и мазков из фекалий телят лучшие результаты получают в течение 4-6 ч после обнаружения признаков диареи. Эпителиальные клетки быстро десква- мируются с поверхности ворсинок кишечника и удаляются с фекальными массами. Чаще всего суспензией фекалий заражают культуру клеток и идентифицируют вирусный АГ в реакции ИФ. Разработан прямой метод ИФ в клетках МДВК, инфицированных культуральным или фекальным вирусным материалом (4, 5). В методических рекомендациях по индикации РВ КРС непрямым методом ИФ предусматривается использование диагностического набора, включающего антиген специфический - культуральную вируссодержашую суспензию клеток ПЭК или МА-104; АГ нормальный - неинфицированную суспензию клеток ПЭК или МА-104; специфическую сыворотку, полученную путем гипериммунизации телят, лабораторных животных; нормальную сыворотку от здорового КРС, не содержащую АТ к РВ; антивидовую сыворотку против глобулинов КРС, конъюгированную ФИТЦ (выпускает Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи). НИФ можно использовать для обнаружения и идентификации РВ АГ в инфицированных культурах клеток, фекалиях и кишечнике больных и павших телят для выявления и количественной оценки АТ к РВ.

РДП. Эго - простой и доступный метод выявления РВ АГ в фекалиях больных телят, содержимом кишечника и суспензии слизистой оболочки кишечника павших или вынужденно убитых телят. Для этого 20%-ную суспензию фекалий в фосфатно-буферном солевом р-ре прогревают в водяной бане при 37°С 30 мин, периодически перемешивая. Затем центрифугируют 15 мин при 8000 g. Надосадочную жидкость фильтруют через фильтр “Милли пор” и фильтрат концентрируют в 25 раз при помощи диализного концентратора. В результате всех этапов обработки 0,2 мл концентрата соответствует 1 г исходного материала фекалий. Источником специфических АТ служат сыворотки реконвалесцентов после ротавирус- ного гастроэнтерита, предварительно проверенные в других серологических реакциях.

РДП проводят в геле агарозы на стеклянных пластинках [0,9% агарозы в буферном р-ре, содержащем 0,1 М NaCl, 0,01 М трис(гидроксиметил)-аминометана и 0,001 М этилевдиа- мингетраацетата]. Компоненты реакции помещают в вырезанные в слое агарозы лунки диаметром 3 мм, отстоящие друг от друга на 3 мм. Пластинки с гелем выдерживают в течение ночи при комнатной температуре, после чего учитывают результаты. Между лунками с АГ и АТ в положительных случаях формируется одна четкая линия преципитации. В РДП испытывается АГ - жидкая часть фекалий или над осадочная жидкость после центрифугирования суспензии фекалий или кишечника, испытуемая сыворотка от переболевших телят, молозиво и молоко в натуральном виде (в виде сыворотки) после обработки сычужным ферментом.

Реакция иммунопреципитации с окрашиванием преципитатов флюоресцирующими АТ может применяться для обнаружения в фекалиях РВ человека и РВ диареи телят. Разработана ее ускоренная модификация (5). Диагностикум, включающий специфический и нор- Глава 1. Family Reoviridae Реовирусные инфекции мальный АГ, специфическую сыворотку, готовят по методике ВИЭВ, а в качестве нормальной сыворотки используют фетальную сыворотку или сыворотку безмолознвных телят. Реакцию оценивают по образованию характерных линий преципитата.

РСК. Для выявления АГ применяется реже других методов. Она менее чувствительна, чем электронная микроскопия и РИФ, чаще дает ложноположительные результаты из-за ан- тикомплементарности многих проб фекалий. Однако при обработке фекалий комплементом, фетальной сывороткой, фреоном, очисткой ПЭГ 6000 или ультрацентрифугированнем, РСК не уступает по чувствительности электронной микроскопии. Реакцию ставят микрометодом со специфической сывороткой или сывороткой недавно переболевших телят, свободной от АТ к другим вирусам.

ВИЭФ. При этой реакции образуется линия преципитации между АГ, движущимся к аноду, и АТ, движущимся к катоду. Качество и чистота агарозы являются основным фактором получения воспроизводимых результатов. Большинство исследователей считают, что этот тест не уступает электронной микроскопии или даже превосходит ее (4).

ВИЭФ предложен для обнаружения РВ в фекалиях и патологическом материале и для выявления АТ в сыворотках крови. Для исследования берут жидкую часть фекалий. Если для исследования жидкой части недостаточно, то пробы фекалий центрифугируют 10-15 мин при 4 тыс. об/мин при 4-10°С. Исследуют надосадочную жидкость. Кишечник мелко измельчают, добавляют равный объем физиологического р-ра, затем гомогенизируют в ступке со стеклом, центрифугируют 10-15 мин при 2 тыс. об/мин при 4-10°С. Надосадочную жидкость используют в реакции. ВИЭФ ставят в 0,85%-ом р-ре агарозы, приготовленной на 0,

5 М веронал-мединаловом буфере (pH 8,6) (4).

ELISA. По чувствительности выше, чем ЭИ, ИФ, РСК, ВИЭФ. Может быть использован в прямом и непрямом вариантах, а также в постановке на латексе. С помощью ELISA можно обнаружить РВ в фекалиях телят при разведении исследуемой пробы до 1:5000. Описан твердофазный ELISA для типирования и деления на подгруппы РВ человека и животных. Для этого используют IgG в концентрации 5 мкг/мл; разведение кроличьей антнсыво- ротки к IgG КРС до 1:400. Продолжительность инкубации IgG -4 ч, реакции АГ РВ с IgG - 3

ч, реакции антисыворотки к РВ с комплексом IgG - РВ АГ -16 ч, для соединения с конъюгатом -4 ч, для изменения цвета субстрата (фосфата Р-нитрофенила) - 10 мнн. Перед исследованием фекалии телят разводят в 4 раза фосфатно-буферным р-ром, осветляют центрифугированием и обрабатывают смесью Твина-20 с азидом натрия. Показания ELISA в 100% случаев совпадают с результатами электронной микроскопии.

Разработана тест-система ИФА на основе РВ свиней для выявления специфического АГ РВ КРС, которая обладает высокой чувствительностью и специфичностью (2). В Российской Федерации разработан иммуноферментный диагностикум, выпускаемый ВИЭВ. Набор включает: специфический лиофилизированный РВ АГ - вируссодержащая суспензия, полученная на культуре клеток МА-104, концентрированная ПЭГ 6000 и центрифугированная при 6000g; контрольный АГ, лиофилизированная специфическая антиротавирусная сыворотка, полученная путем гипериммунизации телят или кроликов вирусом, очищенным в градиенте плотности хлористого рубидия; сухие иммуноглобулины, выделенные из гипе- риммунной антиротавирусной сыворотки методом высаливания насыщенным р-ром (NH,)2S04 С последующей ионообменной хроматографией на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.

Существует ряд других методов для выявления РВ АГ в фекалиях больных диареей телят: реакция обратной пассивной гемагглютинации, метод иммуноагрегатной ГА, реакция агглютинации латекса и др. Так, предложен простой стафилококковый метод для обнаружения РВ в фекалиях новорожденных телят с использованием кроличьей сыворотки к РВ телят. Метод основан на обнаружении РВ агглютинирующего стафилококка в 10%-ой суспензии образцов фекалий на предметных стеклах с золотистым стафилококком, нагруженным

Глава!. Family Reoviridae Реовирусные инфекции РВ АТ. Контролем служат стафилококки, обработанные неиммунной кроличьей сывороткой. Агглютинация видна под микроскопом через 2-3 мин после кругового покачивания стекла. Во избежание неспецифических реакций, проводят предварительную обработку образцов фекалий нагреванием, фильтрацией и N-ацетилцистеином. Такая обработка не снижает специфичности метода. В сравнении с ELISA данный метод оказался чувствительнее; преимущества его - скорость, простота и низкая стоимость, что очень важно для скрининга большого числа образцов фекалий.

Метод агглютинации латекса с использованием коммерческого набора Rotalex для выявления РВ в фекалиях больных столь же специфичен, чувствителен, как и методы электронной микроскопии, ИФ и ELISA. Для дифференциации подгрупп и серотипов изолятов РВ описан метод гибридизации нуклеиновых кислот, электрофорез в ПААТ вирионной РНК вирусов. Метод точечной гибридизации высоко специфичен, позволяет выявлять 8 нг вирусной РНК ив 10-100 раз более чувствителен, чем ELISA (4).

Вариантная идентификация с помощью монАТ. Получены монАТ к шт. RIT4237 (серотип I) РВ КРС. Нейтрализация АГ выявила вариабельную специфичность к групповым и подгрушювым детерминантам. Использованием монАТ против субгрупповых АГ в ELISA было установлено доминирование серотипа II РВ человека в пробах кала больных детей. Наличие таких АТ увеличивает чувствительность и специфичность тест-систем.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика

Серологическое исследование сывороток крови телят имеет весьма ограниченную ценность. В течение первых недель жизни не удается обнаружить прироста АТ, несмотря на прошедшую болезнь. Уровень гуморальных АТ у взрослых животных не позволяет прогнозировать возникновение эпизоотии в стаде.

РСК. Для диагностики РВИ показана возможность постановки РСК с парными сыворотками переболевших животных. В первые дни болезни КСА у большинства животных отсутствуют. К 7-10 дню уровень их возрастает, достигая максимума к 21 дню, затем происходит снижение, и к 30-35 дню титр КСА доходит до нуля. РСК ставят общепринятым методом в микро- и макрообъемах.

РТГА. Ставят по стандартной методике, используемой диагностическими вирусологическими лабораториями. Применяют стеклянные пробирки и обычные объемы реагентов или одноразовые пластиковые панели с лунками и микрообъемы реагентов (4). Для постановки реакции используют эритроциты человека группы О или эритроциты морской свинки. Исследуемые сыворотки обрабатывают каолином и эритроцитарной массой (последнее - при использовании эритроцитов человека). Все разведения готовят на физиологическом солевом р-ре с добавлением 0,04 % альбумина сыворотки КРС.

Непрямая ИФ, PH, радиоиммунологический метод ставятся по общепринятым методикам (4, 5).

Дифференциальная диагностика. РВИ у новорожденных телят следует дифференцировать от коронавирусной инфекции, колибактериоза. Необходимо исключать диспепсию новорожденных телят алиментарного происхождения. Для титрования вирусов группы А разработаны методы дот- и блот-гибридизации РНК с зондами к ДНК геномного сегмента 4, полученными с помощью амплификации в ПЦР гипердивергентных областей гена белка VP4 (нуклеотиды 211-686) к ДНК шт. ИК, IND, NCDV и Сг с использованием олигоиуклео- тидных праймеров. Зонды 3 типоспецифичны (VP4) и не реагируют перекрестно с 2- нитевыми РНК гетерологичных P-типов РВ (20).