ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

В Японии вирус гриппа выделен от диких водоплавающих птиц - лебедей, уток, чаек и др., в том числе подтипов Н7М7, Н5Ш, Н10Ш и Н2№. Изучена патогенность для цыплят 91 штамма вируса гриппа. Большинство вирусных изолятов оказались патогенными для цыплят и только отдельные были практически апатогенны. Они относились к подтипам: Н13Ш, Н13Ш, Н1ШЗ, Н1Ш6 (13).

Особенно часто заболевают домашние птицы с ноября по март в районе Карачи, когда тысячи птиц мигрируют из бывшего СССР через Афганистан и горные хребты в сторону Пенджаба, Белудпастана и провинции Синд. Самым большим пристанищем птиц является озеро Халей в 85 км от Карачи, а также меньшее по размеру озеро Дабей в 35 км от города. Мигрирует около 70 видов птиц, главным образом водоплавающие - утки, пеликаны, фламинго и др. В поисках пищи они часто располагаются на отдых вокруг птицеферм и свалок - обычно в октябре-ноябре регистрируется грипп птиц, инфекционный бронхит, инфекционный ларинготрахеит. К декабрю инфекции широко распространяются и с наступлением холодов у птиц выявляют колисептицемию, микоплазмоз, адено- и реовирусные инфекции. В этот период гибнет до 30% бройлеров и резко снижается яйценоскость (15). Вирулентность ВГП коррелирует с чувствительностью их ГА к клеточным протеазам. Наиболее вероятным ферментом, расщепляющим ГА вирулентных вирусов является, фурин-процессирующая пропротеин-эндопротеаза, родственная субтилизину (22). Показано, что способность расщепления ГА вирусов гриппа птиц в куриных фибробластах определяет их вирулентность (12). Обнаружена гетерогенность популяции ВГП. На молекулярном уровне различия между вирусами были в неструктурном гене (14). Штаммы ВГП, выделенные в 1977-1979 гг. с АГ характеристикой НШ1, характеризовались не только качественными, но и количественными изменениями ГА, в частности, изменением ГА-активности и термостабильности. Нейраминидазы ВГП оказались близкими, но неидентичными в АГ-отношении (7, 5а).

Вирусы гриппа А (НШ1) вызывали эпидемии гриппа на протяжении 2-х периодов: 1933-1957г. и с 1957 г. по настоящее время. Исследования Е.И.Исаевой и соавт. (3) показали, что одна общая детерминанта остается АГ стабильной в составе ГА-вирусов гриппа А подтипа НШ1 начиная с 1933 г, в то время как другая является лабильной. Авторы сделали вывод о нескольких путях дрейфа начального вируса А/СССР/090/77. Наиболее перспективным и иммунологически значимым представляется то изменение, которое обусловливается одновременно сменой 2-х детерминант Г А, свидетельствуя о наиболее интенсивной эволюционной изменчивости (3).

Спектр патогенности в естественных условиях. Он неоднороден и зависит от АГ подтипа. Известны 2 подтипа ВГП: А5 и А7, вызывающих заболевание типа КЧП. Патогенные штаммы, относящиеся к этим подтипам, разрушают протеазу многих клеток и активизируют протеолиз, что и составляет сущность инфекционности вируса. Грипп А7 КЧП чаще поражает птиц семейства куриных, менее восприимчивы водоплавающие птицы.

Дикие утки и др. виды водоплавающей птицы также чувствительны даже к самым слабопатогенным штаммам ВГП и являются не только переносчиками инфекции, но и резервуаром. Сезонные миграции диких птиц вызывают сезонные заболевания болотных птиц.

Проблема межвидовой передачи и реассортации между ВГП, свиней и человека еще не разрешена. Из 14 подтипов вируса гриппа А только 3 обнаруживаются у человека (Н1, Н2 и НЗ). Прошло уже 25 лет с тех пор как из человеческой популяции исчез подтип Н2 вируса гриппа. Однако ген ГА Н2 циркулирует среди птичьих штаммов вируса гриппа (23).

ДИАГНОСТИКА

Поставить диагноз на грипп птиц можно путём выделения вируса и идентификации его в РСК, PH и РТГА, а также выявления специфических АТ в процессе эпизоотии или по прошествии её (ретроспективная диагностика). В нашей стране биопромышленность выпускает 2 диагностических набора: а) набор специфических АГ и сывороток к ним для диагностики гриппа птиц 13-и серотипов; б) диагностический набор для идентификации вируса НБ и ГП (актуального эпизоотического типа). Диагностическими наборами пользуются в соответствии с наставлениями по их применению (5а, 6).

Выделение вируса

Взятие и подготовка материала. В качестве вируссодержащего материала используют селезёнку, головной мозг, синусы, трахею, лёгкие, воздухоносные мешки, кишечник от больной птицы или свежих трупов. Материал в лабораторию доставляют в замороженном виде в термосе со льдом. Инфекционные титры вируса в назальных смывах бывают максимальными через 2-4 дня после заражения птицы и достигают 105-107 ЭИД50/мл смыва. Реизолировать вирусы из клоачных смывов удаётся чаще всего на 5-8-й день после экспериментального заражения птицы.

Заражение куриных эмбрионов. Испытуемую суспензию инокулируют 9-10-дн КЭ (не менее 5 на одну пробу) в аллантоисную или амниотическую (лучше) полости общепринятым методом и инкубируют в течение 72 ч. Экстраэмбриональную жидкость каждого эмбриона раздельно проверяют на ГА-активность капельной РГА с 1%-ной взвесью эритроцитов кур. При отсутствии положительной РГА проводят еще 3-5 слепых пассажей, используя для заражения КЭ эмбриональную жидкость предыдущего пассажа. Если титры Г А низкие, проводят таким же образом еще 2-3 дополнительных пассажа. Проба испытуемого материала считается отрицательной, если в 3-5 слепых пассажах не будет обнаружено ГА и патогенного действия вируса (гибели КЭ). При положительной РГА проводят идентификацию выделенного вируса.

Заражение культуры клеток. В диагностической практике этот метод применяют реже. Вирус после 2-5 пассажей хорошо развивается в культуре фибробластов КЭ. ЦПД обычно проявляется через 24-48 ч (в зависимости от дозы и адаптации). Присутствие его устанавливают при помощи РГА и РГАд. Предложен ускоренный метод титрования инфекцион- ности вируса гриппа в культуре клеток путем подсчета гемадсорбирующих клеток. Метод позволяет получить результат через 8 ч после заражения.

Биопроба на цыплятах. Испытуемую суспензию инокулируют цыплятам 2-3-месячного возраста. Летальную инфекцию у цыплят можно вызвать при любом методе заражения (подкожно, внутримышечно, в мозг, конъюнктиву) подтипами Al, А7 и А5. Заражение per os с кормом и водой удается непостоянно, лишь в случае высокой патогенности эпизоотического изолята гриппа. Зараженные цыплята, как правило, гибнут через 36-72 ч в зависимости от дозы и вирулентности возбудителя.

Индикация и идентификация вируса. Для этой цели широко используют методы ИФ, цитоскопию, биопробу (на птице и КЭ) и серологическую идентификацию. С помощью монАТ можно идентифицировать не только разные группы вирусов (ВГП и ПМВ), но и определять подтипы ВГП и серотипы ПМВ птиц, и даже штаммы внутри одного подтипа, а также локализацию компонентов вириона в зараженных клетках (ЫРВГП - МА клонов 1С6, 5С10, N:2 - МА клоны 303 и т.д.). На основе монАТ можно готовить диагностические препараты для выявления АГ и АТ в РТГ А, НИФ, РСК, ИФА и др. реакциях (4).

РГА. Для индикации вируса в патологическом материале можно использовать РГА. Надосадочную жидкость после центрифугирования суспензии проб из органов и тканей больной птицы, а также смывов исследуют в капельной или пробирочной РГА с 1%-ной суспензией эритроцитов кур или 0,5%-ной взвесью эритроцитов морской свинки. Реакцию учитывают через 20 мин и 1 ч. Специфичность определяют в РТГ А.

Цитоскопия. Метод заключается в исследовании тканевых элементов в отпечатках, полученных со слизистой оболочки верхних дыхательных путей (лучше) и органов. Препараты высушивают и окрашивают одним из методов: по Романовскому, Пигаревскому, Быковскому и т. п. При окраске по Быковскому и Пигаревскому в цитоплазме клеток при гриппе обычно обнаруживают тельца-включения ярко-красного цвета; при окраске по Романовскому - фиолетового цвета. Внутриклеточные включения находят не только в клетках цилиндрического эпителия, но и в цитоплазме макрофагов, лейкоцитов и плоского эпителия. В настоящее время этот принцип исследования используется с применением люминесцентной микроскопии.

Метод простого флюорохромирования. На мазки-отпечатки из органов и смывов наносят 1-2 капли рабочего раствора акридина оранжевого (1:10000), покрывают покровным стеклом и свежий препарат (в течение 10 мин после приготовления) рассматривают в люминесцентном микроскопе. Ядра клеток выявляются по изумрудно-зеленому свечению, РНК плазмы клеток - в виде не резко ограниченных гранул красного или оранжевого цвета. В препарате, имеющем вирус гриппа, выявляются включения в виде четко отграниченных ярко-красных гранул в цитоплазме клеток (5,6).

Серологическая идентификация

Для идентификации гриппа млекопитающих и птиц наиболее простым и высоко достоверным методом является РТГ А. PH - штаммоспецифическая и также высоко достоверная, но используется в диагностике значительно реже. Ее обычно применяют при некоторых неясных и спорных случаях.

РСК. Используют для определения типоспецифичности выделенного вируса, когда в РТГ А не удается установить родственных связей между выделенным и эталонными штаммами вируса гриппа по антисывороткам к ним. В этом случае в РСК с эталонными иммунными сыворотками против вирусов гриппа типов А, В и С устанавливают типовую принадлежность штамма.

В последнее время для типирования нейраминидазы вируса начали применять РТНА, но в диагностической ветеринарной практике она пока еще не применяется. Ее используют, в основном, для изучения АГ связей различных штаммов вируса гриппа.

РТГ А. Идентификацию испытуемого вируса проводят с набором эталонных штаммоспецифических гриппозных сывороток к его АГ вариантам. Для дифференциации в реакцию вводят сыворотку против вируса НБ. РТГА ставят микро- или макрометодом по общепринятой методике.

ИФ. Может быть использована как экспресс-метод диагностики гриппа птиц. Препараты готовят непосредственно ex tempore от убитой больной или свежепавшей птицы. Прямой метод ИФ позволяет определять АГ ВГП в мазках-отпечатках тканей птиц, идентифицировать АГ данного вируса из различных тканей организма, инкубационных яиц, печени зараженных эмбрионов и культур клеток фибробластов; выявить вирусный АГ даже в тех случаях, когда вирус из пораженных тканей выделить не удается.

В ветеринарной диагностической практике для идентификации выделенного вируса РДП не используют, так как необходимы концентрированные и очищенные АГ. В основном применяют ее для изучения АГ структуры вирусов гриппа. Разработаны наборы для ИФА с монАТ, непосредственно обнаруживающие Г А, нуклеокапсидный или матриксный белки вируса гриппа. Идентификацию вирусспецифической нуклеиновой последовательности предлагается осуществлять ПЦР с 2-мя типами праймеров (на основе генов неструктурного белка и Г А) (19). Тест стандартизован для определения АТ к ВГП в сыворотке крови у индеек.

Минимальные АГ различия между вариантами и родительским вирусом выявлялись только монАТ, продуцируемыми клетками гибридомы PEG-1 или фрагментами селезенки гипериммунных животных. МонАТ дают возможность точно проследить филогенетические взаимоотношения между вирусными штаммами в составе субтипа, а в сочетании с методами пептидного картирования и определения последовательности а.к. - выяснить молекулярную структуру АГ участка Г А.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Обнаружение анти-ГА, ВНА и КСА - надежный признак протекающей или уже прошедшей инфекции ГП в стаде.

РТГА. Исследование парных сывороток проводят с диагностической целью при атипичном, часто вялом течении болезни с поражением органов дыхания. Сыворотку от диких птиц на присутствие противогриппозных АТ исследуют при изучении роли перелетных птиц в распространении гриппа. Обязательным условием для ретроспективной диагностики ГП является одновременное исследование парных сывороток, так как для диагностических целей имеет значение сравнительный титр АТ против вирусов различных серологических подтипов в 1-й и 2-й пробах сыворотки. Первую пробу сыворотки хранят при 4°С или в замороженном виде. Обе пробы исследуют одновременно. Перед постановкой реакций сыворотки прогревают при 60°С 30 мин, а затем освобождают от термостабильных ингибиторов, используя С02, КЮ4 и др. методы. Если титр АТ во 2-й пробе сыворотки (через 10-14 дн после заболевания) превышает не менее чем в 4 раза титр АТ к тому же типу вируса в 1-й пробе, то РТГ А считается положительной, подтверждающей диагноз гриппа птиц. При постановке РТГ А с парными сыворотками больных птиц необходимо использовать не только набор эталонных штаммов (например, к вирусам A/Fowl plague, A/Chick/Scotland, A/Turkey, A/Duck), но и местные штаммы того птицехозяйства, где зарегистрирована болезнь. При анализе результатов РТГА необходимо указывать, сколько сывороток было с низким, средним и высоким титром к тому или иному штамму вируса гриппа. В ряде случаев вместо индивидуальных сывороток показатели иммунитета стада (после переболевания или прививки живой вакциной) можно изучить на сыворотках, полученных от нескольких птиц. В этих случаях испытуемые сыворотки, взятые от отдельных птиц, нужно соединять в равных объемах. На протяжении опыта (120 дн после реконвалесценции) в сыворотках кур находили анти-ГА: до 75-го дня титры сохранялись примерно на одном уровне (5-5,8 log2), а в дальнейшем снижались (до 4,4-4,6 log2).

РСК применяют для обнаружения АГ и АТ в целях ранней и ретроспективной диагностики гриппа. Ставят с аллантоисными жидкостями КЭ или с очищенными диагностикума- ми. РДП широкого применения не нашла, так как необходимы высокие концентрации чистых АГ. Среди исследователей нет единого мнения о чувствительности этой реакции. Некоторые авторы указывают, что чувствительность РДП сравнительно невысока, поскольку достоверные положительные результаты получали лишь при исследовании сывороток с титром АТ в РТГ А 1:80 и выше.

Реакция радиального гемолиза. В настоящее время используется для серо-эпидемио- логических исследований и при оценке эффективности противогриппозных вакцин. РРГ с ВГ А обладает выраженной штаммовой специфичностью: диаметр зон гемолиза с гомологичными АГ при исследовании сывороток хорьков, зараженных 6-ю различными вирусами, были в 1,5-3 раза больше, чем с гетерологичными. При правильном подборе штамма РРГ может быть с успехом использована для определения анти-ГА.

Таблица VIII.4. Лабораторные методы дифференциации КЧП и НБ Маркеры Вирусы КЧП (H7N1) Вирус НБ Экспресс-диагностика (РГ А) взрослых кур + - цыплят + + РГА с эритроцитами: петуха + + лошади + - кошки + - Чувствительность ГА к действию азотистой кислоты. + - Адсорбция ГА на формалинизированных эритроцитах, предварительно обработанных:: вирусом КЧП - + вирусом НБ + - Лабораторная диагностика: Выделение вируса на КЭ + + Сроки гибели заражённых: эмбрионов (зависит от дозы) До 30 ч Более 30 ч птицы 48 ч 96 ч Патогенность для: мышей - + - голубей - - + Титр ГА в XАО/титр ГА в аллантоисной жидкости >1 <1 Чувствительность к фотодинамическому действию мети- + - леновои сини Обозначения: (+) - положительные результаты;

(-) - отрицательные результаты

Показано хорошее совпадение результатов титрования АТ в ELISA, РСК и ИФ. Однако в ELISA значительно выше (титр 1:481-1:1520), чем в РСК и РИФ. Сенсибилизацию лунок панелей проводят РНК-АГ вируса гриппа А. Предложен новый метод приготовления АТ эритроцитарных диагностикумов к вирусам гриппа, которые с успехом могут быть изготовлены на основе любых штаммов вируса гриппа. Они позволяют определять типовую принадлежность эпизоотических и межэпизоотических штаммов ВГП, свиней и лошадей (1).

В практической работе врачу ветеринарной лаборатории, возможно, придется встретиться не только с гриппом кур и уток, но и с гриппом индеек. Умея диагностировать грипп кур и уток, имея набор диагностикумов, врач лаборатории при необходимости сможет поставить диагноз при гриппозной инфекции индеек.

При респираторных вирусных болезнях КРС, свиней и птиц (грипп, парагрипп, РС- инфекция) разработан направленный тест. Это новый иммуноферментный мембранный тест быстрого обнаружения вирусов гриппа в носоглоточных смывах. Чувствительность направленного метода Р1и-А составляла 90%. С помощью этого теста более легко обнаруживается клеточно-ассоциированный АГ, присутствующий в клинических пробах, чем свободный вирус. С помощью Р1и-А теста удалось обнаружить вирусы гриппа А птиц (субтипы ГА НЗ и Н6) и свиней (НШ1) в клоачных смывах и гомогенатах (16).

Дифференциальная диагностика. КЧП (Н71Ч1) и другие формы гриппа птиц следует отличать от НБ, ИБ, ИЛТ, гемофилеза и респираторного микоплазмоза. Для идентификации вирусов НБ и КЧП используется диагностический набор (табл.УША).

В сомнительных случаях для дифференциального диагноза ставят PH на КЭ и заражают птиц, иммунных к вирусу НБ.