ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

ИНАН характеризуется выраженной стационарностью, сезонностью и определенным ареалом. Болезнь чаще встречается в летне-осеннее время, в лесисто-болотистых с кислыми неполноценными почвами, в период массового размножения и лёта жалящих насекомых (гнус). Массовое заболевание лошадей наблюдают преимущественно в годы с жарким и сухим летом, а зимой и весной и в горных местностях - в виде спорадических случаев. Эпизоотия может продолжаться от 3-5 мес до 1-2 лет, протекая остро и подостро. Затем начинает преобладать хроническое (медленное) и латентное течение. Факторы, ослабляющие резистентность животного организма, - неполноценное кормление и сильное раздражение нервной системы животного, вызванное укусами кровососущих насекомых ( 1, 4, 8).

Спектр патогенности в естественных условиях. В естественных условиях болеют лошади всех возрастов и пород, а также ослы и мулы. Заболевшие жеребята часто погибают. Ослы более устойчивы к вирусу ИНАН, чем лошади. Болезнь у них чаще протекает подостро и хронически. В литературе описано несколько случаев ИНАН, кровь которых была заразна для лошадей.

ДИАГНОСТИКА

Диагноз на ИНАН ставят комплексно. Учитывают эпизоотологические особенности болезни, результаты клинического, гематологического и лабораторного исследований, патологоанатомические и гистологические изменения. Эпизоотологические данные собирают непосредственно в хозяйстве, учитывая давность и характер болезни, пути заноса инфекции, динамику заболеваемости и падежа лошадей за несколько предшествующих лет. Принимают во внимание, что массовые вспышки ИНАН наблюдаются исключительно летом и осенью, а спорадические случаи - в любое время года. Кроме традиционного подсчета эритроцитов, убедительным диагностическим методом является подсчет числа звездчатых лейкоцитов.

При клиническом обследовании учитывают различия в течении болезни, рецидивирующий тип лихорадки при подострой и хронической анемиях, кровоизлияния на слизистых оболочках, исхудание при нормальном аппетите, шаткость зада, отеки, повышенную возбудимость сердца (аритмия, учащение пульса). Повышенную возбудимость сердца устанавливают функциональной пробой: пробег 50 м, подсчет пульса каждые 5 сек в течение 0,5 мин. Результат от деления первой цифры подсчета на последнюю цифру у больных анемией лошадей должен составлять 2,5-3. Гематологическим исследованием обнаруживают лимфоци- тоз, анемию (уменьшение числа эритроцитов в 4-8 раз по сравнению с нормой), увеличенную СОЭ. Убедительным диагностическим тестом является подсчет звездчатых лейкоцитов. Из патоморфологических изменений для острого течения болезни наиболее характерными являются бледность и желтушность слизистых и серозных покровов и подкожной клетчатки, точечные геморрагии в конъюнктиву, слизистую оболочку носа, увеличение селезенки, печени, почек, усиление пролиферации лимфоидных клеток и гистиоцитов в этих органах и отложение гемосидерина в печени при одновременном уменьшении количества его в селезенке.

Взятие и подготовка материала. В лабораторию направляют для серологического исследования 5-6 мл сыворотки крови лошадей, которую консервируют мертиолятом 1:10000 или путем добавления антибиотиков (пенициллина и стрептомицина по 1000 ЕД/мл) и хранят при температуре 4-8°С. Сыворотки без консерванта хранят в замороженном состоянии. Для гематологического исследования направляют 10-12 мл крови, стабилизированной 20%- ным р-ром лимоннокислого натрия. Кровь берут до поения и кормления животного. Для гистологического исследования берут кусочки печени, селезенки, сердца, легких, лимфоузлов и почек от павших или убитых с диагностической целью лошадей. Материал помещают в 10%-ный р-р формалина. Толщина кусочков не должна превышать 2 см. Для постановки биопробы на жеребятах берут по 300-500 мл крови от наиболее подозрительных по заболеванию ИНАН лошадей во время подъема температуры.

Индикация и идентификация вируса

Биопроба. В сомнительных случаях для проверки особо ценных лошадей ставят биопробу на жеребятах. При исследованиии сывороток лошадей-продуцентов ставят групповую биопробу. С этой целью из благополучного хозяйства берут 2-х жеребят в возрасте 6-12 мес, 4-

кратно, с интервалом 7 дн, их обследуют клинико-гематологически и серологически. Затем жеребят заражают сывороткой крови или плазмой, полученной от больных лошадей.

Биологическую пробу считают положительной при наличии у зараженных жеребят характерных клинических симптомов, рецидивирующей лихорадки, слабости, бледности или желтушности слизистых оболочек, исхудания и при получении положительных результатов серологических и гематологических исследований. Жеребят, давших сомнительные результаты клинико-гематологических и серологических исследований, убивают и исследуют патологоанатомически и гистологически. При положительном результате обнаруживают серозно-геморрагическую инфильтрацию подкожной и межмышечной клетчатки, гиперемию и отек лимфоузлов, зернистую или жировую дистрофию скелетных мышц, миокарда, почек, множественные кровоизлияния на слизистых, серозных оболочках и под капсулой органов. Селезенка сильно увеличена вследствие кровенаполнения пульпы. Печень гиперемирована, увеличена, с выраженной дольчатостью на разрезе, паренхима имеет мускатный рисунок. Во всех органах появляется реакция ретикулоэндотелиоза. Биопробу считают отрицательной при отсутствии у подопытных жеребят симптомов болезни, отрицательных результатов серологических и гематологических исследований. Групповую биопробу проводят путем заражения двух жеребят смесью сыворотки (плазмы) крови 10-15 лошадей-продуцентов. Смесь вводят подкожно по 100-200 мл каждому жеребенку.

Гистологические исследования. Приготовленные срезы органов окрашивают гематок- силин-эозином общепринятым методом. Срезы для исследования на гемосидерин окрашивают по Перлсу. Характер и степень изменений зависят от стадии болезни, количества рецидивов, ремиссий и их продолжительности.

При хроническом течении болезни могут быть следующие изменения: в печени - диффузные пролифераты лимфоидных клеток и в меньшей степени мелких гистиоцитов, содержащих гемосидерин. У животных, павших в период тяжелого обострения, в печени находят скопления крупных гистиоцитов, нагруженных гемосидерином. В селезенке - диффузная гиперплазия и резкое уменьшение количества гемосидерина или его полное исчезновение. У лошадей, павших во время приступа, в селезенке отмечают повышенное кровенаполнение синусов и очаговое скопление эритроцитов в пульпе. В почках - продуктивный гломеруло- нефрит, сосудистые клубочки увеличены и обогащены ядрами. Между канальцами и вокруг сосудов скопления лимфоидных клеток. У животных, павших во время тяжелого лихорадочного приступа, в полости капсулы сосудистых клубочков находят серозный, а иногда се- розно-геморрагический экссудат, гемосидерин - в клубочках и гистиоцитах. В сердце - очаговый или диффузный интерстициальный миокардит с преимущественным поражением предсердий (особенно левого). В лимфоузлах - лимфоцитоз и незначительное отложение гемосидерина. В легких - пролифераты лимфоидных клеток и гистиоцитов, нагруженных гемосидерином. В поздних стадиях болезни в почках отмечают цирроз и склероз сосудистых клубочков.

Гематологические исследования. Включают определение количества гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов, СОЭ, лейкоцитарной формулы. У больных животных отмечается лимфоцитоз, особенно при подостром и хроническом течениях болезни. СОЭ резко увеличена, особенно в первые 15 мин (60-70 делений). Исследование крови проводят через каждые 3 дн во время приступов лихорадки и не реже 1 раза в 10 дн в период ремиссий. Количество эритроцитов и лейкоцитов подсчитывают в камере Горяева (или в электронном счетчике) по общепринятой методике. Гемоглобин определяют по общепринятому методу гемометром Сали, полученный результат выражают в процентах. При анализе лейкоцитарной формулы следует учитывать, что у здоровых жеребят в возрасте до 4-6 мес может иногда наблюдаться повышенный процент лимфоцитов (до 60 %) (табл.XI.5). В начале болезни при первом подъеме температуры резкие отклонения от нормы количества эритроцитов и процента гемоглобина, как правило, отсутствуют. У хронически больных ИНАН животных эти показатели восстанавливаются до нормы, а СОЭ остается повышенной. В качестве дополнительных методов диагностики ИНАН используют исследование костномозгового пунктата в динамике болезни - наиболее характерные изменения появляются во время лихорадки: резко уменьшается количество клеток эритробластической группы и увеличивается количество клеток гистиоцитарно-моноцитарной группы. Во время длительных ремиссий при хроническом течении болезни состояние клеток костного мозга не отличается от такового у здоровых лошадей.

Таблица XI .5, Показатели крови здоровых и больных лошадей Вид исследований Здоровые лошади нормальной упитанности Больные ИНАН Эритроциты, млн/мм3 5-9 4,5 и ниже Гемоглобин, г% 7,6 5,0 и ниже СОЭ, делений за 1 ч 45-60 66 и более Лейкоциты, тыс/мм3 7-10 Без изменений Лимфоциты, % 25-35 60-75

Определяют количество сидероцитов в периферической крови, которое увеличивается с приступами лихорадки в течение 3-4 дн и часто продолжает нарастать после снижения температуры тела. При рецидивах количество сидероцитов достигает 2 тыс. и более на 10 тыс. лейкоцитов в 1 мм3 крови, у лошадей с незначительной реакцией повышение числа сидероцитов иногда является единственным ранним показателем заболевания ИНАН. Определяют количества гамма-глобулина в сыворотке крови, содержание которого у больных лошадей резко возрастает, а отношение между альбуминовой и глобулиновой фракциями понижается. Делают биопсию - прижизненное извлечение кусочков печени с последующим гистологическим исследованием.

ИФ. В 1970 г. японские исследователи разработали метод непрямой ИФ для идентификации вируса ИНАН лошадей в культурах лейкоцитов лошади. Для этого используют цельную сыворотку крови лошади или очищенную фракцию иммуноглобулинов. Метод эффективен только при высокой концентрации вируса. С его помощью можно проследить динамику репродукции вируса в инфицированной клетке.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика

РДП. Реакция нашла широкое применение в бывшем СССР. Она выявляет АТ к вирусу в сыворотке крови при остром, хроническом и латентном течении инфекции. Помимо селезенки от больных животных в качестве АГ можно использовать вирус ИНАН, культивируемый в культуре лейкоцитов лошадей и инактивированный твином-80 и эфиром. В СНГ для РДП биопромышленность выпускает диагностикум.

РСК. Одна из первых серологических реакций, предложенных для диагностики ИНАН. Японскими исследователями показано, что вирус, полученный в культуре лейкоцитов, можно использовать в качестве АГ в РСК с сыворотками больных ИНАН лошадей. КСА появлялись у 79,1% экспериментально зараженных лошадей через 17-40 дн после введения им вируса, у 78,2% - через 7-20 дн после появления первой температурной реакции, у некоторых больных лошадей титр АТ возрастал непосредственно перед температурной реакцией или сразу после нее. АТ в крови больных лошадей обнаруживали от 2 до 60 дн. Вторично в крови больных они не выявлялись.

РТГА. В отличие от РДП РТГА - более простой метод количественного определения АТ к вирусу ИНАН. Авторы обнаруживали анти-ГА в крови жеребят одновременно с АТ, выявляемыми в РДП. РТГА проводили в объеме 0,1 мл с 0,2%-ной взвесью эритроцитов морской свинки и 4 ГАЕ вируса. Перед постановкой ее сыворотки прогревают и адсорбируют активированным углем. В качестве АГ служит концентрированная вируссодержащая культуральная жидкость. Для культивирования вируса используют субкультуру кожно-мышечной ткани эмбриона лошади.

НИФ. Установлена возможность использовать ее для определения АТ к вирусу ИНАН. С 5-го дня после заражения монослоя дермальных клеток очаги концентрации АГ в виде ярких пятен флюоресценции располагались внутри цитоплазмы в околоядерной области и имели диаметр 0,5-3 мкм. Тест ИФ выявляет более низкие уровни АТ, чем РДП.

ELISA. Разработан ELISA с очищенным вирусным протеином Р26 в качестве АГ с конъюгатом, реагирующим с IgG лошадей. Источником вируса служит сокультура перевиваемой линии дермальных клеток лошади, персистентно инфицированная вирусом, и клеток почки эмбриона лошади. Обработка АГ в аффинной хроматографии позволяет освободиться от появления неспецифических линий преципитации в РДП и повышает специфичность. Оказался более чувствительным и эффективным по сравнению с РСК и РДП. Титр АТ, выявляемый методом, был в 1-2 тыс. раз выше, чем в РДП, и в 4 раза выше, чем в РСК (19, 43). Наибольшая корреляция между 2-мя тестами отмечена на 21-й день и позднее после заражения. АТ в ELISA удается обнаружить через 1-4 г после заражения. Этот метод предложено использовать и для определения вирусного АГ, а также для оценки качества вакцин (50)

. С 1983 г. в США диагностика ИНАН осуществляется конкурентным ИФА. Конкурентный метод ELISA для обнаружения АТ оказался в 5-10 раз чувствительнее обычно принятого теста РДП (40). Помимо этого, для выявления АТ к вирусу ИНАН в сыворотках предложено использовать в качестве АГ синтетические белки, соответствующие какому-либо антигенному сайту вируса. Хорошие результаты были получены с белком, состоящим из аминокислотных последовательностей 68-91 или 76-99 белка GP-45 оболочки вируса. АТ можно также определять различными видами ИФА - прямым методом, конкурентным и методом 1- 2-ступенчатого сэндвича. Рекомендуются повторные серологические исследования лошадей на ИНАН, поскольку в определенных фазах болезни лошади могут реагировать негативно.

Для идентификации вируса ИНАН в культуре лейкоцитов лошади японскими учеными предложен и непрямой ИФА. Однако этот метод оказался эффективным лишь при наличии большой концентрации вируса в клетке. Для выявления вируса в сыворотке крови лошади с острым и подострым течением болезни можно использовать РГА (2). На ранней стадии болезни выявить АТ к вирусу ИНАН позволяет ИФ (20). Некоторые авторы (19) наиболее надежным и чувствительным методом индикации вируса ИНАН у лошадей считают метод заражения пони.

Дифференциальная диагностика

При постановке диагноза на ИНАН следует исключить пироплазмоз, нутталиоз, трипаносомоз, лептоспироз, грипп, ринопневмонию. Для пироплазмоза характерна сезонность: апрель-май или август-сентябрь. Болезнь протекает остро, при исследовании крови обнаруживают пироплазмы. При нутталиозе максимум больных выявляют в июне. Болезнь протекает остро и подостро. В крови находят нутталии. У лошадей, больных гемоспорвдиозами, наблюдается резкая желтушность слизистых оболочек, имеющая стойкий характер, при ИНАН она отсутствует. При гемоспоридиозах с первых же дней наблюдается резкое учащение дыхания - одышка (отек легких); у больных ИНАН со стороны органов дыхания, как правило, особых отклонений от нормы нет. Наконец, при гемоспоридиозах у жеребят болезнь протекает латентно, а при ИНАН - тяжело, сопровождаясь высокой смертностью. Лептоспироз исключается на основании исследования сывороток крови больных по реакции микроагглютинации и лизиса, отсутствия лейкоцитоза и наличию лептоспир в моче. Болезни вирусной этиологии (грипп, ринопневмония) отличаются от ИНАН высокой контагиозно- стью, быстрым распространением, коротким течением. При диагностике этих болезней применяют лабораторные методы: выделение вируса на КЭ и культурах клеток и дальней- шая их идентификация в серологических реакциях. Характерным симптомом гриппа лошадей является сухой резкий кашель; вирус ринопневмонии вызывает у жеребых кобыл аборты во второй половине жеребости. Однако отличием абортов, вызванных вирусом ринопневмонии, является отсутствие повышения температуры тела в день аборта и после него. Аборты, причиной которых служит ИНАН, происходят во время лихорадки или выраженной анемии и истощения.

ИММУНИТЕТ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА

Иммунитет изучен недостаточно. Долгое время затяжной характер течения ИНАН н длительное переживание (перснстенция) возбудителя в организме животных объясняли нарушением или снижением иммунной реакции организма на вирус. И лишь исследованиями последних 2-х десятилетий были обнаружены в сыворотке крови больных лошадей КСА (30, 45), ПА (17,18, 23), ВНА (46) и ИФ (11) АТ. АТ выявляют в период между 14-120-м дн после заражения, а иногда и на протяжении всей жизни животного. Однако связь между АТ и степенью невосприимчивости лошадей к вирусу выяснена недостаточно. Так, образующиеся ВНА не способны предотвратить рецидивы болезни или нейтрализовать вирус. Последние, покрывая эритроциты, способствуют их быстрому разрушению, вызывая анемию. Установлено, что 99% инфекционного вируса ИНАН, циркулирующего в крови, связано с АТ в виде комплексов “АГ-АТ” (36). Недавно японские исследователи (32), изучая действие иммунодепрессантов на лошадей, зараженных вирусом ИНАН, пришли к выводу, что иммунитет при этой болезни обусловлен функцией лимфоцитов. Показано также, что вирус ИНАН в процессе длительного персистирования в организме лошади значительно изменяет свои биологические свойства, что ставит под сомнение возможность эффективной вакцинации против этой болезни (47). В последнее время в ряде стран (Франция, Япония, США) ученые ведут интенсивные исследования по созданию вакцинных препаратов.

Профилактика и меры борьбы. До 1977 г. инфицированность поголовья лошадей в США составляла 8-10%. Организация контроля инфекции на основе серологической диагностики, ограничений на перемещения и убой инфицированных животных снизили этот показатель до 0,42-1,0 % (15). Поскольку лошади, больные ИНАН, и вирусоноснтели являются опасными источниками возбудителя инфекции, при организации профилактики и мер борьбы необходимо своевременно выявлять и уничтожать таких животных (28, 33, 42). Для предупреждения заноса вируса в хозяйство вновь поступающих лошадей содержат изолированно от остального поголовья (карантинируют) и в течение месяца тщательно исследуют. Хозяйство, в котором установлена ИНАН, объявляют неблагополучным, на него накладывают карантин и выполняют мероприятия согласно инструкции. Проводят тщательный клиниче-. ский осмотр и исследование кровн лошадей. В зависимости от результатов исследований животных делят на 3 группы: больных, подозрительных по заболеванию и подозреваемых в заражении. Явно больных лошадей убивают. Продукты убоя после проварки используют в корм плотоядным и птицам. Животных 2-й группы изолируют н тщательно исследуют до уточнения диагноза (не более 45 дн). Больных уничтожают. Лошадей 3-й группы ежедневно термометрируют и 2 раза в месяц подвергают врачебному осмотру. Животных используют для работы в пределах неблагополучного хозяйства. Для предохранения лошадей от жалящих насекомых их опрыскивают 3%-ным р-ром креолина, а во время работы используют ленточные покрывала, пропитанные 10%-ным р-ром креолина. Помещения в неблагополучном хозяйстве дезинфицируют 4%-ным р-ром едкого натра 2 раза в месяц до снятия карантина, а также после каждого нового случая выявления болезни. Изоляторы дезинфицируют ежедневно, навоз из них сжигают. Навоз из неблагополучных конюшен обеззараживают биотермически. Карантин снимают через 3 мес после последнего случая убоя или падежа животного при условии, что в хозяйстве не осталось больных животных илн вирусоносителей (при исследовании в РДП), для чего целесообразно провести групповую биопробу. Вы воз лошадей в другие хозяйства разрешается через 3 мес после снятия карантина и получения отрицательных результатов исследования сывороток крови в РДП. Согласно последним научным и практическим разработкам по лабораторной диагностике болезни предложено накладывать ограничения на неблагополучный по ИНАН пункт вместо применяемого ранее карантина, где проводят мероприятия согласно новой инструкции. Запрещают ввод и вывод лошадей, проводят поголовный клинический осмотр и серологические исследования. Последующие мероприятия проводят в зависимости от результатов лабораторных исследований. Ограничения с хозяйства снимают после удаления всех положительно реагирующих лошадей, получения 2-кратного отрицательного результата в РДП с интервалом между исследованиями в 45 дн и проведения заключительных ветеринарно-санитарных мероприятий. Через 3 мес проводят 1-кратное контрольное исследование всего поголовья в РДП (1,2, 5,10).