ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

ДИАГНОСТИКА

Диагноз на ИБ ставят на основании эпизоотологических данных, клинических признаков болезни, патологоанатомических изменений и лабораторных исследований (выделение и идентификация вируса и обнаружение специфических АТ у переболевших птиц).

Экспресс-диагностика. Разработан быстрый предварительный метод диагностики и типнрования ВИБ. Для этого из аллантоисной жидкости зараженных КЭ выделяют РНК, на базе которой синтезируют к ДНК, которую используют для постановки ПЦР.

Указанный метод типирования штаммов основан на амплифицировании фрагмента к ДНК вируса величиной 400 пар оснований из N-терминальной области S2 гликопротеиново- го гена, который обрабатывают рестриктазными ферментами и определяют длину фрагментов путем электрофореза в ПААГ. Фрагменты разных штаммов вируса сравнивают между собой. Различие их АГ структуры подтверждено в PH (28).

Диагностику клинических образцов коронавируса индеек удается успешно осуществлять, используя специфические однонитевые зонды, приготовленные с помощью ПЦР (37).

Выделение вируса

Взятие и подготовка материала. Для исследования от больной птицы берут смывы с трахеи, гортани во время инкубационного периода или проявления ярких клинических признаков. От вынужденно убитых или только что павших птиц берут кусочки легких, почек, соскобы трахеи, гортани, бронхов, от взрослой птицы - почки и яйцеводы. В период острого течения болезни вирус может быть выделен из яиц. Испытуемый материал до исследования можно хранить прн температуре -20-70°С в течение недели. Из образцов взятого материала готовят 10%-ную суспензию на р-ре Хенкса или изотоническом буферном р-ре, центрифугируют 15 мин при 2-3 тыс. мин'1. Надосадочную жидкость обрабатывают антибиотиками (2000 ЕД/мл пенициллина и 1 мг/мл стрептомицина), выдерживают 1,5-2 ч при 4°С и используют для заражения чувствительной системы (КЭ, культура клеток почек КЭ или фибробластов цыплят 10-25-дн возраста).

Заражение куриных эмбрионов. Используют 8-10-дн эмбрионы; суспензию испытуемого материала инокулируют в дозе 0,2 мл в аллантоистую полость 5-10 КЭ и инкубируют прн 37°С, ежедневно овоскопируя. Все погибшие в течение 24 ч КЭ не учитывают (гибель неспецифическая).

Признаками поражения КЭ ВИБ считают гибель их на 2-8-й день (летальность зависит от вирулентности полевого штамма) и характерные патологические изменения. ВИБ быстрее адаптируется при инокуляции в амниотическую полость, чем в аллантоисную и на ХАО. Для подтверждения наличия вируса в экстраэмбриональной жидкости зараженных КЭ можно поставить РГА, предварительно обработав материал трипсином. Для этого к одному объему вируссодержащей суспензии добавляют один объем трипсина, разведенного 1:100. Вместо кристаллического трипсина можно использовать аморфный, разведенный 1:500. Затем смесь вируссодержащей аллантоисной жидкости и трипсина инкубируют 3 ч при 37°С и добавляют одну часть 1%-ного куриного белка. Реакцию ставят с 1%-ной взвесью куриных эритроцитов по общепринятой методике. Параллельно также обрабатывают нормальную аллантоисную жидкость, используемую в качестве контроля. С нормальной аллантоисной жидкостью можно наблюдать неспецифическую агглютинацию в титре 1:4-1:8.

Вируссодержащую жидкость собирают в стерильные пробирки и после проверки на отсутствие бактериальной загрязненности помещают в холодильник при -20°С. Перед использованием ее оттаивают, центрифугируют при 2500 мин'1 10 мин и надосадочную жидкость используют для дальнейшей работы (титрование, идентификация вируса).

Биопроба на цыплятах. Используют цыплят 10-25-дн возраста из хозяйств, благополучных по респираторным болезням и ИБ. Суспензией, полученной из патологического материала, заражают 10 цыплят интратрахеально по 0,2-0,3 мл. За птицей ежедневно наблюдают в течение 7 дн, отмечая симптомы болезни. Первые признаки болезни появляются через 18-36 ч, а иногда через 4-5 ди. У птиц отмечают хрипы, насморк, кашель, чихание, затем угнетение и сонливость. Заболевают 10-100% зараженных птиц. Случаев падежа может не быть. Через 7 дн цыплят вскрывают. Изменения в органах дыхания, свойственные бронхиту, при наличии респираторных симптомов дают основание для постановки предварительного диагноза. При вскрытии в носовой полости, трахее, бронхах, бронхиолах и воздухоносных мешках обнаруживают обильный серозно-слизистый экссудат.

Заражение культуры клеток. Этот метод при первичной изоляции вируса не находит практического применения. Только после 6-10 пассажей на КЭ изолированный вирус приобретает способность размножаться и вызывать ЦПД в культурах клеток почки, легких и печени 15-18-дн КЭ. Выделение ВИБ удается с первого пассажа при использовании метода органной культуры трахеи зараженных цыплят. На КЭ вирус не всегда удается выделить. Этот метод удобен тем, что не требует предварительной адаптации вируса к КЭ. Для выделения ВИБ 1-дн цыплят заражают испытуемым материалом, убивают через 3-4 дня и готовят органную культуру из трахеи, помещая в питательную среду трахеальные кольца. За состоянием органной культуры наблюдают 7 дн; о действии вируса судят по прекращению движений ресничек слизистой оболочки.

Для выделения вируса предложили использовать органную культуру трахеи 19-днКЭв качестве чувствительного метода изоляции вируса. Показатель заражения - цилиостаз - прекращение движения мерцательного эпителия спустя 3 дня после инокуляции культуры.

Описан простой, надежный, чувствительный и недорогой метод определения ВИБ при использовании аллантоисных клеток. Метод заключается в заражении испытуемым материалом 6-дн SPF-КЭ в аллантоисную полость. Через 48 ч инкубации при 37°С аллантоисную жидкость собирают, центрифугируют при 700g и 4°С в течение 10 мин. Клетки ресус- пендируют в ФБР в 1/20 первоначального объема, наносят на стекло, высушивают на возду хе, фиксируют в ацетоне. Далее клетки обрабатывают куриной антисывороткой против ВИБ. Затем, после отмывания, окрашивают конъюгированным ФИТЦ'ем кроличьим ангикури- ным IgG. Тест ИФ аллантоисных клеток также чувствителен, как и метод бляшек или пассирования на КЭ, но имеет преимущество в скорости и простоте при выявлении ВИБ (20).

Титрование вируса. Титрование вируса на КЭ производят общепринятым методом. Вируссодержащий материал разводят мясопептонным (от 10'1 до 10'8) бульоном и определяют ИД50 или ЛД50 (в зависимости от патогенности штамма). Зараженные КЭ просматривают ежедневно в течение 8 дн. Уменьшение массы зараженных эмбрионов, по сравнению с контрольными на 25 % и более, рассматривают как результат действия вируса. Высокий титр последнего получают при заражении 10-11-дн КЭ адаптированным штаммом, и материал берут от живых эмбрионов через 30 ч после инфицирования. Вирус в экстраэмбрио- нальной жидкости зараженных эмбрионов устанавливают РГА с трипсинизированным вирусом, а принадлежность выделенных вирусов к инфекционному бронхиту PH, РДП и РЗГА с гипериммунными специфическими сыворотками кроликов и кур.

При титровании на восприимчивых цыплятах учитывают способность вируса вызывать респираторные симптомы. Обычно глубоко адаптированные “эмбриональные” штаммы утрачивают способность вызывать поражения у цыплят. При титровании вируса цыплят заражают аэрозольно, вводят материал интратрахеально или интраназально в объеме ОД мл, на каадое разведение берут по 4 цыпленка. Подопытных и контрольных цыплят содержат изолированно. Наблюдение ведут 7 дн. Проявление клинических признаков экспериментальной инфекции зависит от биологической природы титруемого штамма. При отсутствии выраженных симптомов подопытных цыплят убивают и учитывают патоморфологические изменения. Признаки болезни обычно проявляются на 2 - 4-й день. Метод бляшек может быть с успехом использован для количественного учета инфекционной активности ВИБ.

Идентификация вируса. Идентификацию вируса проводят при помощи PH, РДП, РЗГА, РСК, РНГ А, ИФ и др. PH и РЗГ А - типоспецифические и используются при определении серологического типа вируса. РДП и РНГА идентифицируют вирус без выявления типовой принадлежности. РСК устанавливает штаммоспецифичность в пределах одного АГ типа.

PH на куриных эмбрионах. Для ее постановки требуется следующее: типоспецифические иммунные сыворотки ко всем эталонным сероварам. В нашей стране используют специфические сыворотки в PH к трем первым сероварам: Массачусетс, Коннектикут, Айова- 97, а также нормальные сыворотки, испытуемый вирус, мясо-пептонный бульон или р-р Хенкса, пенициллин и стрептомицин, 8-10-дн КЭ. Чаще ставят PH с различными разведениями вируса и постоянной дозой сыворотки.

Зараженные КЭ инкубируют при 37°С в течение 8 дн, ежедневно овоскопируют, погибших эмбрионов в первые 24 ч не учитывают. PH считается положительной, если нет гибели эмбрионов и при вскрытии нет изменений, характерных для ВИБ, т.е. размножение вируса будет подавлено АТ. Результаты оценивают по индексу нейтрализации. При индексе 1 lg PH считается отрицательной, от 1 до 2 lg - сомнительной, выше 2 lg - положительной.

Вирус можно идентифицировать также в PH на культуре клеток почек КЭ или фибробластов. Специфическая сыворотка ингибирует цитопатический эффект, вызванный ВИБ. Однако адаптация выделенного вируса к культурам клеток удается не сразу, поэтому необходимо проводить несколько пассажей.

PH является высокочувствительной и типоспецифической, но она трудоемка, окончательный ответ по ее результатам учитывают на 7-8-й день. Так, как ВИБ имеет несколько серологических типов, то в случае появления типичных изменений у КЭ (отрицательная реакция) со специфическими сыворотками необходимо поставить РДП, которая идентифицирует вирус без учета его типовой принадлежности.

РДП. Компоненты реакции: специфическая сыворотка к ВИБ (желательно, набор диагностических гипериммунных сывороток к вирусам ИЛТ, БН, оспы птиц и др.); нормальная сыворотка; специфический АГ (ХАО КЭ через 48 ч после заражения ВИБ); испытуемый АГ (ХАО КЭ через 48 ч после заражения полевым вирусом); 1%-ный агаровый гель.

Для РДП в агаровом геле при использовании аллантоисной жидкости в качестве АГ оптимальная концентрация ВИБ оказалась разной для различных штаммов ИБ. Так, для шт. Коннектикут (Konnektikut) - 20 у, шт. Австралия, Массачусетс, Арканзас (Arcansas), Айова (Ajowa) - 68 у, для шт. Дж.МК, изолятов из Новой Зеландии - 120 у. Более высокой АГ- активностью обладали аллантоисные жидкости после обработки их полиэтиленгликолем, протаминсульфатом и сульфатом аммония (43).

РСК. Применяют в диагностической практике редко. Для ВИБ используют АГ из аллантоисной жидкости КЭ, инфицированных вирусом. Реакцию проводят обычным способом в макро- и микровариантах. В обоих случаях используют 1,5 и 2 дозы комплемента, инкубацию АГ и антисыворотки проводят при 4°С 18 ч. Вследствие разной степени антикомпле- ментарности АГ рекомендуется проводить индивидуальный подход к определению дозы комплемента; для АГ подбирают дозу в диапазоне 1,5-2 ед. в предварительном опыте.

РИФ. Метод не уступает по чувствительности методу выделения вируса на КЭ. Для РИФ используют осадок клеток, полученный при центрифугировании смыва. Из него делают мазки на предметных стеклах, подсушивают на воздухе, фиксируют ацетоном при комнатной температуре и окрашивают по общепринятой методике (прямым или непрямым методом). Фиксированные мазки можно хранить в фольге или целлофане при -20°С. При размножении ВИБ в КЭ часть пораженных клеток ХАО выпадает в аллантоисную полость. В связи с этим для РИФ можно использовать мазки из осадка после осветления аллантоисной жидкости центрифугированием при 3000 мин'1.

Успешно использовали прямая ИФ для выявления АГ ВИБ в органах инфицированных цыплят, а также в клетках ХАО КЭ, инфицированных изолятами ВИБ. Свечение в клетках КЭ отмечали уже через 5-25 ч после заражения, что позволяло сократить срок обнаружения вируса. В исследованиях авторов в качестве флюоресцентной метки вместо изотиоционата флюоресцина был использован родаминсульфохлорид. Наилучшие результаты при определении АТ к ВИБ в сыворотках кур с помощью непрямого ИФА достигается при использовании в качестве субстрата для размножения вируса клеток СЕК, взятых через 36-48 ч после заражения. Использование в качестве АГ шт. Массачусетс (М41) обеспечивало возможность выявления АТ ко всем другим штаммам ВИБ (44).

Серотипизация с помощью ИФ возможна в 70% случаев при использовании группоспецифических монАТ или гипериммунной сыворотки. Это новый и очень быстрый метод диагностики ИБ, что позволяет при необходимости в короткий срок изменить программу вакцинации неблагополучного поголовья птицы (50).

РЗГА. Используется для быстрого типирования изолятов ВИБ и определения уровня АТ к вирусу любого серовара. Для приготовления АГ вируссодержащую аллантоисную жидкость эмбрионов концентрируют и затем обрабатывают фосфолипазой С. С помощью РЗГА идентифицированы шт. Ark99 и Hollend, считающиеся идентичными по результатам PH.

ЭМ и ИЭМ. Материал для электронной микроскопии должен быть достаточно очищенным и концентрированным. Для индикации и идентификации вируса используют ИФА. В качестве индикаторных АТ используют IgG из крови кур или кроликов, иммунизированных шт. М41, а также кроличьи антикуриные IgG. Для выявления АГ метод оказался высокоспецифичным. Он позволяет выявлять только нуклеопротеидный (NP, 50 кД) вирусный белок. В PH шт. М41, А-5968 и L2 почти ие перекрещиваются, тогда как в ИФА высоко перекрестно реактивны, что указывает на то, что NP вируса ИБ является общим АГ. Получен очищенный и специфический АГ ВИБ для ИФА без предварительной концентрации вируссодержащей аллантоисной жидкости (45).

Тест интерференции. Предложен между ВИБ и НБ (шт. В1).

Идентификация с помощью монАТ. Индикация вируса в инфицированных тканях удавалась методом основного иммунопероксидазного теста с монАТ.

В США разработан основной непрямой ИФ метод обнаружения ВИБ в срезах замороженных тканей патматериала (ХАО, трахеи, легких и железах прямой кишки птиц). Патологический материал, взятый от птиц перед постановкой реакции, обрабатывают 0,28% -ным р-ром перйодистой кислоты для инактивации эндогенной пероксидазы. Ткани эмбрионов из- за отсутствия последней в такой обработке не нуждаются. При постановке теста используют конъюгат пероксидазы и стрептовидина, а также монАТ к ВИБ. МонАТ должны относиться к подклассу IgG2a. Субстратом служит аминоэтилкарбазол. Тест позволяет обнаружить вирусный АГ в ХАО КЭ и тканях респираторного тракта цыплят через 15 и 90 ч после заражения, соответственно (32).

Непрямой ИФА диагностики ИБ с помощью монАТ, полученных к белку нуклеокапсида вируса (шт. М41), позволяет выявлять вирус в инфицированных клетках почки цыплят, в мазках трахеи экспериментально зараженных цыплят (39).

Серо- и ретроспективная диагностика. Серологические исследования позволяют быстрее поставить диагноз, определить степень распространения ВИБ. В то же время серологические данные не позволяют судить о резистентности исследуемой популяции, так как не всегда уровень АТ коррелирует с резистентностью. Серодиагностика основана на выявлении АТ у больных и переболевших птиц в реакциях (PH, РДП, РЗГА, РНГАидр.).

Как для серодиагностики, так и для оценки поствакцинального иммунитета при ИБ птиц вместо сыворотки крови можно использовать желтки яиц. Для этого их предварительно смешивают 1:1 с 0,01 М фосфатным буфером (pH 7,2) и добавляют равный объем хлороформа, тщательно встряхивают, отстаивают при комнатной температуре 1 ч, центрифугируют при 1500g. Супернатант используют вместо сыворотки крови, предварительно нейтрализовав комплемент при 56°С 30 мин.

PH. Сроки образования ВНА и их уровень в сыворотке крови и желтке яиц при ИБ зависят от вирулентности вируса и возраста инфицируемой птицы, а также от сроков перебо- леванкя птицы и исследования яиц на присутствие АТ в желтке. В основном ВНА накапливаются с 10-го по 36-й день болезни и сохраняются в сыворотках крови до 483 дня, достигая наивысшего уровня в течение 6 нед. Перед постановкой реакции все исследуемые сыворотки прогревают при 58°С30мин, добавляют пенициллин и стрептомицин по 100-1000 ЕД/мл. Для постановки реакции необходимы эталонные, адаптированные к КЭ штаммы. Чаще всего используют шт. Бодает типа Массачусетс, который вызывает гибель КЭ через 24-48 ч. Менее пригодны штаммы, вызывающие только задержку роста (карликовость), так как это затрудняет учет результатов.

Если для 20% и более сывороток результат PH получится сомнительным (индекс нейтрализации от 1 до 2 lg), то рекомендуется исследование повторить в РДП. При сомнительных результатах РДП необходимо повторно исследовать ту же группу птиц через 14-24 дня.

Для обнаружения и количественного определения АТ к ВИБ рекомендуется использовать реакцию микронейтрализации в культуре клеток почек КЭ. Постановка PH с разведением сыворотки позволяет определить уровень АТ в различных стадах птиц, тогда как при разведении вируса и постоянной концентрации сыворотки этой цели не достичь.

РДП. Реакция особенно ценна для быстрой диагностики острых случаев болезни, так как АТ можно обнаружить между 7-м и 21-м дн после начала болезни (оптимальное время 15 дн). Однако с помощью РДП АТ к ВИБ выявляются лишь в 10-15% случаев. В случае 5 выявления большого процента преципитирующих сывороток стадо птицы считают неблагополучным по ИБ.

РНГА. Более ранний иммунологический ответ цыплят, инфицированных вирусом ИБ, можно выявить РНГА. Образование АТ, выявленных РНГА, наблюдалось с 2-го по 14-й день после заражения ВИБ. Средний титр их в эти же сроки составлял 9,2. АТ, выявляемые с помощью РНГ А, сохранялись 111-187 дн.

Нормальную сыворотку получают из крови кролика, которую берут из сердца, она не должна иметь следов гемолиза эритроцитов. Кроличью сыворотку прогревают в водяной бане при 56°С в течение 30 мин и истощают формализированными и танизированными эритроцитами. С этой целью к 10 объемам сыворотки добавляют 1 объем осадка эритроцитов, тщательно перемешивают и выдерживают в водяной бане при 37°С 30 мин, затем центрифугируют при 3000 мин'1 15 мин, сливают и хранят 3 мес.

В главный опыт РНГА берут эритроциты, которые дают равномерную гомогенную взвесь без наличия гемолиза и спонтанной агглютинации. Реакцию ставят на плексигласовых досках. РНГА наиболее удобно ставить микрометодом при помощи аппарата Такачи и Титертека. В этом случае исследуемые и контрольные сыворотки разводят двукратно в объеме 0,025 мл, а затем добавляют по одной капле (0,025 мл) эритроцитарного диагностикума.

ELISA. Достаточно быстрый, высокочувствительный, дешевый; позволяет исследовать одновременно большое количество образцов. Его можно использовать в лабораториях для обследования птиц на ВИБ. ELISA наиболее чувствителен и быстрее, чем PH, РЗГА и др., выявляет специфические АТ. Дает возможность определить в сыворотках специфические lg G спустя 3-4 дня, тогда как ВНА обнаруживаются не ранее 3 нед. В трахеальном секрете IgA и IgG выявляют на 3-7-й день, а ВНА - на 17-й день и в очень низком титре.

ELISA- оптимальный метод объективной оценки содержания специфических АТ у цыплят - бройлеров (40). С помощью ELISA перекрестные серологические реакции установлены между шт. В42, Grey типа Делавар и А-5968 типа Коннектикут, хотя в PH перекрестные реакции были выражены слабо. ИФА оказался чувствительным, экономичным и простым методом лабораторной диагностики ИБ (29), тем более при использовании одного разведения сыворотки (34).

РЗГА. В нашей стране РЗГ А при ИБ не нашла широкого применения, однако за рубежом она успешно используется. С помощью этой реакции выявляют более высокие титры АТ, чем в PH. Для титрования анти-ГА к ВИБ рекомендовано использовать промокательную бумагу. Для этого в пробу взятой от кур крови опускают конец полоски фильтровальной . бумаги "Ватман N3" размером 51 см. После насыщения кровью полоски подсушивают и отправляют в лабораторию, где их выдерживают 2 ч при 37°С, после чего хранят при 4°С. При проведении анализа из полоски вырезают два кружка диаметром 4,8 мм, которые помещают в одну лунку микротитровальной пластины. Сыворотку с дисков элюируют в 100 мкл ФБР путем встряхивания в течение 2 ч с последующим выдерживанием в течение ночи при 4°С. Полученный материал соответствует разведению 1:10 нативной сыворотки. Его используют для постановки РЗГА. Снижение титра проб на фильтровальной бумаге при хранении в течение 33 нед при 4°С было небольшим (6). i Относительно корреляции между титрами сыворотки в PH и РЗГ А мнения ученых раз- •

личны. По данным Kanfhold et.al (25) такая корреляция имелась при исследовании 3-х ; штаммов ИБ. PH для ГА может быть заменена более простым серологическим тестом - > РЗГА. Авторы использовали штаммы ВИБ М42/н52 и датские варианты Д 274/Д 207 и Д i 1466/Д212. Противоположные данные приводят Cavanogh и др. (12). Они не установили корреляции между напряженностью иммунитета и содержанием в сыворотке крови ВНА и анти-ГА, уровень которых достигал максимума через 4 нед после иммунизации.

Чем выше уровень поствакцинальных гуморальных АТ, тем меньше уровень снижения яйценоскости при заражении птицы вирусом.

Дифференциальная диагностика. При дифференциальной диагностике ИБ следует учитывать его сходство с ИЛТ, НБ, гриппом, гемофилезом и др (см.табл. V.3. и V.4.).

ИММУНИТЕТ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА Переболевшая птица резистентна к заражению гомологичным штаммом вируса в течение 5-6 мес. Трудность в проблеме специфической профилактики обусловлена большой естественной АГ и иммунологической вариабельностью полевых штаммов вируса. К вирусу ИБ высокорезистентны цыплята линии С и высокочувствительны - линии 151. Для профилактики инфекции применяют живые и инактивированные вакцины. Отработана технологическая схема изготовления как моновалентных инактивированных форм вакцин против ИБ, БН, ИББ, синдрома снижения яйценоскости. Испытания поливалентной вакцины показали наличие высокого уровня АТ к вирусам ИБ, БН, ИББ, ССЯ76 после вакцинации инактивированными вакцинами (42).

Применение инактивированных вакцин. Достаточно эффективными оказались эмульгированные вакцины из концентрированного вируса. Введение инактивированной вакцины в 3 и 16-нед возрасте дало такой же эффект, как и прививка живыми вакцинами: первый раз вакциной Н-120 (120 пассажей вируса прививка живыми вакцинами: первый раз вакциной из шт.Н120 (120 пассажей в КЭ) и вакциной из шт. Н52 (52-ой пассаж вируса в КЭ). Наиболее выраженный иммунный ответ у 100% цыплят получен при вакцинации в 3-нед возрасте живой вакциной из шт. Н120, а в 16-нед возрасте - инактивированной эмуль- синвакциной (10). Рекомендовано при конструировании инактивированных вакцин против ИБ использовать несколько штаммов (создавать поливалентную вакцину).

Применение живых вакцин. Штаммы, полностью утратившие вирулентность, практически неиммуногенны. Поэтому живые вакцины готовят из аттенуированных штаммов, обладающих различной степенью остаточной вирулентности. Для первой прививки применяют более аттенуированные и менее иммуногенные штаммы, для второй - более вирулентные. Живые вакцины применяют орально ( с питьевой водой) или путем закапывания в нос. Введение живой вакцины в зоб цыплятам создавало устойчивость к заражению без образования циркулирующих АТ (24). Эти данные свидетельствуют о важной роли местного иммунитета при ИБ. Материнские АТ от иммунных кур-несушек передаются через яйцо цыплятам, которых они защищают в первые 2-4 нед жизни от ИБ. Период полужизни материнских АТ составляет немногим более 5 дн. Со второй недели жизни титр их начинает снижаться. Оптимальный возраст для вакцинации цыплят живыми вакцинами составляет 2-3 нед (19). Учитывая корреляцию титра ВНА в сыворотках крови кур-несушек и в желтке яиц, был предложено использовать последние для оценки иммунитета в PH. Яйца, снесенные в течение 60 дн после повторной вакцинации содержат высокий уровень (концентрацию) АТ (31).

Последовательная вакцинация живыми вакцинами разных типов обеспечивает накопление в сыворотке крови птиц широкого спектра АТ, которые превосходили даже типы, примененные для вакцинации. Полученный от иммунизации против ИБ молодняк за счет материнских АТ IgG-класса устойчив к заражению патогенным вирусом. Вирусспецифиче- ский IgG обнаружен и в желтке яиц больных ИБ кур в течение 60 ди.

Сотрудниками ВНИВИП создана живая вакцина из аттенуированного штамма ВИБ. В неблагополучных пунктах иммунизируют всех цыплят в 10-15-дн возрасте 2-кратно через 14-

15 дн. Ревакцинируют птиц в 100-120-дн возрасте. Вакцину вводят интраназально или с питьевой водой. В последние годы в России применяют вакцины против ИБ производства различных зарубежных фирм. Таблица У.З. Дифференциальная диагностика респираторных болезней птиц (по А.А. Ибрагимову, 1981)

Инфекцион

ный

бронхит

Респираторный ми- коплазмоз

Адено

вирусная

инфекция

Инфекционн ый ларингот- рахеиг

Острая высоко контагиозная инфекция, клинически пр являющаяся у цьпшят до 60 дн Продолжительность болезни 8-10 дн

Хроническая чаще латентная инфекция, клинически проявляющаяся при неблагоприятных условиях. Болеют птицы преимущественно в возрасте 30- 180 дн

Острая контагиозная инфекция, клинически про- яляющая-ся у гггиц до 15-дн воз-

раста.Продол житель ность болезни 8-10 да

Острая контагиозная болезнь пре- имущественн о цыплят в возрасте 60- 180 да Продолжительное тью 10-15 дн

Гиперемия, отек легких, скопление слизи и мелкие точечные кровизлия- ния в слизистой трахеи, се- розно-слизис тый экссудат в просвете бронхов и полости воздухоносных мешков Серозно-ката ральный ринит, синусит, скопление слизи и зернистость слизистой трахеи, помутнение воздухоносных мешков

Серозно - катаральный ринит, синусит, трахеит, катаральная пнев мония, некротический панкреатит, гепатит

Фибринозно- геморрагический ларинготра- хеиг

Гиперемия, диффузный серозный отек и диапедезные кровоизлияния, сопровождающиеся лимфоидно- гистиоцитарной инфильтрацией, гиперплазией и метаплазией респираторного эпителия

Гиперсекрецдя и гипертрофия слизистых желез, лимф о ф о лликуляр ная реакция и диффузная лимфоцитарная инфильтрация, обусловливающие трубчатое удлинение желез, аэросаккулит, эндо- и перибронхиг, неравномерное утолщение и полипообразное разрастание слизистой трахеи Гиперемия, псевдо эозинофильная ин фильтраиця, бурная пролиферапщ респираторного и железистого эпителия, обусловливающая полную или частичную обтурацию просветов бронхов и парабронхов Гиперемия, гемор рагии, псевдоэозино фильная инфиль траиця и выпот фибринозного экссудата с десквама- цдей и пролифера- цией респираторного и железистого эпителия

Диффузый серозный отек, гиперплазия и метаплазия респираторного эпителия слизистой оболочки трахеи и бронхов

Лимфоцитарная инфильтрация и лимфоретикулярная реакция, обус ловливающие аэросаккулит, эндо- и перибронхиг, неравномерное утолщение, полипообразное разрастание слизистой трахеи

Гиперплазия и метаплазия респираторного и железис того эпителия, содержащего внутри ядерные базофиль ные включения

Фибринозногеморрагический ларинготрахеиг, десквамация и пролиферация эпителия, содержащего внутриядерные ацидофильные включения Таблица V.4. Бактериальные инфекции, сопровождающиеся респираторным синдромом Болезнь Эпизоотологические

особенности Патологоанатомические

изменения Г истологические изменения Диаг

ноз Аспергип-

лез

Колисегаи

цемия Острая, реже хроническая болезнь, вспышке которой способствуют неблагоприятные условия. Болеет птица в возрасте 1-150 дней

Острая септическая, которой способствуют неблагоприятные условия, респираторные инфекции. Про- долж8-15 дн. Болеет птица преиму- щест- венно в 30-140 дней Фибринозная пневмония, аэросаккулиг и некрозы (гранулемы) размером 1- 5 мм с характерной концентрической слоистостью

Фибринозный аэросаккулиг, пневмония, перикардит, сальпингит Гиперемия, отек, псев- доэозно-фипьная и эпителиоидно-клеточ- ная ифипьтрция, со- провождающаяся развитием некроза с гигантоклеточной и гранулематозной реакцией по периферии Гиперемия, псевдоэо- зинофильная инфильтрация, выпот фибринозного экссудата и микробная тромбоэмболия с некрозами, с гигантоклеточной и грануломатозной реакцией по периферии Обнару

жение

мице

лия

гриба в

зоне

некроза

Температурочувствительный мутант ВИБ (тип Арканзас) получен путем серийного пассирования при пониженной температуре (35-28°С). Вирус, в основном, размножался в верхних дыхательных путях и очень слабо в других органах. Он оказался авирулентным для 3- 7-дн цыплят-бройлеров. Доза вакцины, обеспечивающая 100% защиту привитой птицы, составляла 103-105 ЭИД50. Вакцинация 2-нед цыплят аэрозольно или закапыванием в глаз вакцины из шт. Н120 создавала устойчивость примерно к 31-му дню (5).

При оценке различных программ вакцинации против ИБ в компании Питман Моор сравнивали титры АТ в реакциях задержки гемагглютинации и нейтрализации. Цыплят первый раз иммунизировали в возрасте различными живыми вакцинами, а повторно - в 16- нед возрасте инактивированными адьювант вакцинами из шт. М41 или СУ101. В итоге установлено, что уровень АТ у привитых цыплят был выше к вирусу М41, чем к вирусу серотипа Д207. У птиц, иммунизированных вакциной из шт. М41 и ревакцинированных убитой вакциной из двух штаммов, имелись более высокие титры АТ к серотипам Массачусетс и Д207 (22). Аттенуированные вакцинные шт. Массачусетс 33 и Н120 персистируют в трахее и легких с 3 до 13 дн после вакцинации.

Связь титров антител с резистентностью. Нет прямой зависимости напряженности иммунитета от уровня ВНА. В резистентности птицы важную роль играет местный тканевой иммунитет респираторного тракта. Цыплята, вакцинированные аэрозольно живым вирусом, резистентны, даже если в сыворотке крови нет специфических АТ. Установлена прямая зависимость между устойчивостью птицы к заражению вирулентным вирусом и наличием обширных гистопатологических изменений в гарднеровых железах после вакцинации.

Оценку степени иммунитета у вакцинированных цыплят можно проводить по активности. реснитчатого эпителия трахеальных эксплантатов, полученных после трахеального контрольного заражения. Интраназальная или интраокулярная иммунизация суточных цыплят с наличием материнского иммунитета вакцинным шт. Н120 обеспечивает устойчивость против интратрахеального заражения патогенным ВИБ (5). Эффективность вакцинации против

ИБ вакцинами из шт. Массачусетс и Арканзас оценивается на основании выделения ВИБ из трахеальных тампонов после 1-нед периода заражения в полевых условиях (23).

Установлена иммунологическая совместимость вирус-вакцины из шт. Н120 ВИБ и ви- русвакцины из шт. Бор74 ВГНКИ вируса НБ при ассоциированном применении аэрозольным способом. Продолжительность иммунитета против ИБ и НБ составляла 120 ди (47).

Попытка разработать способ вакцинации против ИБ in ovo не дала явно положительных результатов. Вакцины Iboral 1 или Bioral Н120 приводили к развитию лишь незначительных поствакцинальных реакций со стороны респираторной системы у вылупившихся цыплят. На 15-й день после вакцинации (12-й день после вылупления) в сыворотках цыплят определялись повышенные титры АТ в РЗГА по сравнению с контролем. Вакцина Iboral 1 приводила к некоторым нарушениям диаграммы вылупления.

Серологическая оценка поствакцинального иммунитета. Эффективность вакцины оценивается по разным критериям, из которых основным являются клинический ответ, но- сигельство и диссиминация вируса, реакция трахеального эпителия in vivo и in vitro, защита от вирулентного гомологичного и гетерологичного типов ВИБ, образование секреторных и гуморальных АТ. Для оценки профилактической эффективности вакцинации цыплят против ИБ предложен клиренс-тест.

Длительность циркуляции поствакцинальных антител. Высокий уровень АТ достигается к концу 3-ей нед и регистрируется в течение года. На прививку инактивированной вакциной ВНА в сыворотках крови цыплят и кур появляются с 7-14-го дня в титрах 5-7 log2, нарастают к 30-60-му дню до 8-10,5 log2 и сохраняются на таком уровне до 6 мес.

Пассивный иммунитет. В желтке яиц, полученных от кур-реконвалесцеитов, имеются АТ, которые затем передаются цыплятам. Уровень их у цыплят сразу же после вылупления высокий, затем в течение 4 нед постепенно снижается. Пассивные АТ не предотвращают респираторную инфекцию у цыплят, но несколько ослабляют течение болезни. Материнские АТ обеспечивали устойчивость цыплят к заражению в течение 3 нед.

Связь титров антител с носительством и выделением вируса. Предложен метод определения напряженности иммунитета у вакцинированной птицы после ее заражения вирулентным вирусом путем выявления вирусного АГ с помощью флюоресцирующих АТ. Кроме того, предложена оценка поствакцинального иммунитета на основе активности ресничек в кольцах трахеи. При изучении гуморального иммунитета установлена тесная корреляция между активностью реснитчатого эпителия и выделением вируса из тканей, что послужило основанием рекомендовать первый тест в качестве критерия оценки местного иммунитета при определении перекрестного иммунитета. Однако корреляция между уровнем АТ и численностью подверженных к заражению ВИБ птиц незначительна. Резистентность связана с клеточным опосредованным иммунитетом, что подтверждено методом бласттрансформации лимфоцитов и реакцией гиперчувствительности замедленного типа (16). Оценка иммунитета у птиц, привитых инактивированными вакцинами, основана на обнаружении ВНА и ПА. Обычно через 2 нед после второй вакцинации индекс нейтрализации составляет 3 lg. С помощью ИФА можно достоверно оценить как поствакцинальный, так и постинфекционный статус у экспериментально зараженных птиц. Метод не является специфическим для серо- типирования ВИБ, ио высокочувствителен для выявления АТ в сыворотке крови. Данные, полученные методом ИФА, при оценке иммунного статуса, хорошо совпадают с результатами, полученными в других серологических реакциях: PH, РЗГ А, вирусовыделения и реакции ткани трахеи (36).

Установлена тесная корреляция между активностью мерцательного эпителия и гистологическими изменениями, вызванными вирусом, и незначительная - между титрами АТ (в PH и РНГА) и напряженностью иммунитета. Однако не установлено корреляции между показателями клеточного и гуморального иммунитета у цыплят, иммунизированных инактивированной эмульсинвакциной. Установлена корреляция титров ВНА в сыворотках крови и желтках яиц и вакцинированных кур.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Сергеев В.А. Вирусные вакцины, Киев, "Урожай" 1993. 2.Фомина Н.В. и лр. Вирусы животных, MBA,1991 :112. З.Сюрин В.Н. и др. Диагн. вирус, бол. жив. "Агропромиздат" 1991 :335. 4.СюринВ.Н. и др. Част, ветеринарная вирусология. М. "Колос", 1979 :409. 5.Tarcha В. et.al. Acta vet Hung 1991, 39,1/2 :83. 6.Amboli A.G. et.al. Rev roum virol 1990, 41, 3-4 :151. 7.Amboli A.G. et.al. Anim Helth Pwd 1991, 39, 2 :213. 8.Balia Z. et.al. Magy allatow lapja 1986, 41 :531. 9.Balla Z. et.al. Magy allatow lapia 1986, 41 :531. lO.Brussow H et.al. J Gen Virol 1988, 69 :1647. ll.Batcher G.D etal. Avion Dis 1989, 33, 4 :823. 12.Cavanagh D etal. G Gener Virol ,1986. 13.Cavanagh D et.al. J Avian Pathol, 1987,

61 :1. 14.Cavanagh D. et.al. Avian Pathol 992, 21, 1 :33. 15.Chandra M Poultry Sc. 1987, 66, 6 :954. 16.Chubb R. Huynh Avian Pathol, 1988, 17, 2 :371. 17.Cook G. Paultry World 1986, 140, 20 :6. 18.Collisson Ellen W, et.al. Poult Sci Rev 1992, 4, 1 :41. 19.Darbyshire J.H. et.al. Res Vet Sci, 1985, 38 : 14. 20.Endo Munoz.B. et.al. Austral veter J 1989, 66, 10 :338. 21.DoiMoncito et.al. Kitasato Arh Exp Med 1992, 1 :73. 22.Finney P.M et.al. Avian Pathol. 990, 19, 3 :435. 23.Gelb J.Jr et.al. Avian Dis. 1989, 33,

4 :764. 24.MacDonald J.W .et.al. Zootech Intern, 1984, 4 :44. 25.Kaufhold C. et.al. Tierarztl Umsch, 1988,

43, 9 :595. 26.Koch G. et.al. Nucl Acids Res 1990, 18, 10 :3063. 27.Kusters J.G. et.al. Virology 1987,

169 :217. 28-Lin Z. et.al Arch Virol, 1991, 120, 1-2 :145. 29.Muneer M. A. et.al. Avian Dis 1988, 32, 1 :137. ЗО.Мипеег M.A. etal. Pakist veter J 1989, 9, 2 :57. 31.Mockett A.P. etal. Avian Pathol, 1987, 16,

407 :493. 32.Nagi S.A. Avian Dis 1990, 34, 4 :893. 33.Niesters H.G.M. et.al. Virology 1987, 161, 511. 34.

Penzes Z., et.al. Acta vet hung 1992, 40, 4 :311 . 35.SadasivEileen C. et.al. J Virol Meth.1991, 33, 1-2 : 115. Зб.Того H.J. Veter Med Ser B.,1988, 35, 2 :109. 37.Verbeek A. et.al. Arch Virol 1991, 121, 1-4 .199. 38.Williams Anna K. et.al. Virus Res 92, 25, 3 :213. 39.Yagyu K. et.al Avian Dis, 1990, 34, 2 :246. 40.Zojac J. et.al. Vet med, 1992, 37, 1 :57. 41.ZwaagstraK.A. et.al. Clin Microbiol, 1992, 30, 1 :79. 42.Дубовой A.C. и др. Тез. н.-пр. конф. ВНИИЗЖ, Владимир, 1995, 253. 43.Lohr J.I. Avian Dis, 1980, 24,

2 :463. 44.Feng W. et.al. Zootech.Sin. 1994, 25, 2 :163. 45.Токарских В.В. и др. Тез. н.-пр. конф. ВНИИЗЖ, Владимир, 1995, 268. 46.Cook Jane К.А. et.al. Avian Pathol 1992, 21, 4 :681. 47.Бирман Б.Л.

. и др. Вет. наука - произв, 1992, 30 :15. 48.Borzemska W. et.al. Med. Vet., 1993, 49, 2 :76. 49.Sapats S.I. etal. J Gen Virol, 1996, 77, 3 :413. 50.Wit J.J. de. et.al. Avian Pathol. 1995, 24, 3 :465.