РОТАВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Патогенез. РВ размножается в дифференцированных эпителиальных клетках ворсинок (в апикальной части ворсинок) всего тонкого отдела кишечника. На вершинах ворсинок происходит ускоренная миграция и преждевременное слущивание энтероцитов. Ускоренная регенерация поверхности апикальной части ворсинок за счет незрелых, резистентных к вирусной инфекции эпителиальных клеток и крипт, является причиной нарушенного пищева-

Глава 1. Family Reoviridae Реовирусные инфекции рения уже после окончания инфекционного процесса. В дальнейшем происходит восстановление нормальной структуры ворсинок и пищеварения (15).

Симптомы и патологоанатомические изменения. Инфекция клинически проявляется только у телят в виде рецидивирующей диареи. Заболеваемость достигает 90%, смертность - 5-25%. Наиболее часто болезнь регистрируют поздней зимой и ранней весной. Телята заражаются в первые часы после рождения. У заболевших в первые дни жизни телят наблюдаются диарея, атония, слабость, отказ от воды. В отсутствие сопутствующих заболеваний РВИ телят вызывает энтерит, который связан с незначительными изменениями крови и может сопровождаться легко проходящей диареей. Клинически болезнь у телят характеризуется депрессией, потерей аппетита, диареей. Цвет фекалий зависит от вида корма. Температура тела иногда поднимается до 41°С. Если инфекция не осложняется E.coli, то через 2-3 дня телята выздоравливают. Чем моложе теленок, тем продолжительнее диарея.

При патологоанатомическом исследовании основные изменения отмечаются в тонком кишечнике. Мебус (1974) нашел, что верхушки ворсинок часто обнажаются, увеличивается количество ретикулоподобных клеток. В отдельных участках кишечника ворсинки полностью исчезают, крипты укорочены, ворсинки неоднородны, форма эпителиальных клеток изменена (они принимали кубическую форму), в них появились вирионы, и это вело к изменению функции клеток. Поступающее в кишечник молоко не переваривается, накапливается в пищеварительном тракте, обусловливая появление диареи. По мере накопления вирус выходит из клеток ворсинок. У переболевших животных изменения в кишечнике исчезают через 8-10 суг после начала заболевания.

На патогенность РВ и тяжесть течения болезни у телят могут влиять многочисленные факторы: штамм и доза вируса, возраст телят во время инфицирования, возможные сопутствующие инфекции. Наличие циркулирующих в крови АТ недостаточно для предотвращения РВ диареи у телят. АТ должны находиться в просвете кишечника. Для защиты может оказаться полезньм экзогенный интерферон.

ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ

В 1978 г. Международным Комитетом по таксономии отнесен возбудитель РВИ к семейству Reoviridae, роду Rotavirus.

Устойчивость. Устойчив к хлороформу, эфиру, фреону, кислой среде (pH 3-4). В отличие от реовирусов MgCl2 при pH 6-7 не стабилизирует терморезистентность вирионов РВ в течение 1 ч при 50°С. РВ высокорезистентны к протеазам. В отличие от реовирусов интакт- ные вирионы РВ устойчивы к химотрипсину. Полевые иггаммы-изоляты (Cody и Lincoln) вируса сохраняют свои свойства в течение нескольких месяцев при -60°С и менее 30 дн при 4°С. Оба изолята стабильны при pH 3, резистентны к прогреванию, но погибают при 50°С за 1 ч в присутствии 1 М MgCl2. 10% формалин, 5% лизол инактивируют вирус за 2 ч.

Морфология и химический состав. Изучены недостаточно. Описаны частицы РВ 2-х типов, вызывающие диарею у телят: частицы плотностью 1,38 г/см3, диаметром 55±0,4 нм и частицы плотностью 1,36 г/см3, диаметром 66±0,4 нм.

Антигенная структура, вариабельность и родство. Вирус, выделенный из фекалий больных диареей телят, был первым этиологическим агентом диареи неонатальных телят. Изучение морфологии, частичная характеристика нуклеиновой кислоты очищенного вируса, отсутствие чувствительности к липидным растворителям и поведение в культуре клеток по-

Глава 1. Family Reoviridae Реовирусные инфекции зволило предположить, что вирус относится к группе вирусов, содержащих 2-нитевую РНК, куда включены реовирусы 3-х типов и вирус блутанга. Однако он серологически не связан с реовирусами 1, 2 и 3-го типов. В АГ отношении РВ телят и человека очень близки, но не идентичны. Обнаружена общность группоспецифических и типоспецифических АГ РВ телят и человека.

АТ к РВ телят реагируют с внутренним и не реагируют с внешним капсидным слоем РВ человека. Однако сыворотки детей, переболевших гастроэнтеритом, реагируют с обоими слоями капсида РВ человека и телят. Эго позволило предположить, что 2 капсидных слоя отличаются друг от друга: АГ внутреннего слоя - групповые АГ, общие для ротавирусов телят, мышей человека, в то время как АГ наружного слоя - типо- или видоспецифические. У 54% детей, больных гастроэнтеритом, в начале заболевания в фекалиях найдены РВ, которые оказались серологически родственны аналогичным вирусам телят.

Геном РВ состоит из 11 фрагментов 2-спиральной РНК с мол.м. 0,2-2,2 МД. РВ КРС присуща значительная вариабельность вирулентности и антигенности. Известны 3 серотипа возбудителя и, кроме того, у КРС выявлены АТ к 3-м серотипам РВ человека (25).

3, 4, 5, 6, 8 и 9, но он давал перекрестную нейтрализацию с прототипиыми шт. В223 и Е4049 и был отнесен к серотипу 10 (8, 9). АГ специфичность связана с полипептидами наружного капсида. Белок VP7 является основным протективным АГ РВ КРС, ответственным за образование ВНА. До сих пор не выяснено, играет ли гликопротеин VP7 РВ такую же роль, как отдельные белки вирусов гриппа, ответственные за АГ “дрейф” (16,18,19).

В процессе персистентной инфекции (13) заражение разными серотипами РВ КРС не сопровождается перекрестной защитой. Проводили вирусологическое наблюдение за телятами с признаками диареи, вызванной РВ КРС на закрытой молочной ферме. Вирус выделяли из 32 образцов (всего исследовано 219) фекалий от телят преимущественно 2-6-нед возраста за период 1992-1993 гг. При электрофоретическом анализе 2-цепочечных геномных РНК вируса 32 штаммов картина их миграции была сходной с таковой у преобладающих штаммов РВ КРС, выделенных на этой же ферме в 1990-1991 гг. С помощью тестов нейтрализации вируса и ПЦР все штаммы идентифицированы как серотип G6 и Р5. Таким образом, электрофоретическая характеристика геномной РНК и АГ-свойства РВ КРС не изменились за период (1990-93 гг.) циркуляции в изолированном молочном стаде (14). Однако РВ КРС является серологически родственными с РВ человека лишь по групповой АГ детерминанте и индуцирует выработку, в основном, видоспецифических ВНА, естественно малоэффективных для нейтрализации РВ человека (3, 26). Этим, в частности, можно объяснить относительно невысокую эффективность вакцины на основании РВ КРС при иммунизации детей раннего возраста (30,31).

В 1974 г. впервые была показана серологическая связь между РВ телят и человека. Они имеют общий АГ, выявляемый в РСК, установлено родство РВ телят, свиней, жеребят и кроликов (в РСК, РИФ и РДП) (22, 21). Группоспецифические АГ этих вирусов локализованы во внутреннем капсиде РВ. Получен реассортанг первого типа РВ КРС WC-3, шт. W179- 9, который индуцировал политипичный АТ ответ у детей раннего возраста (11).

Локализация вируса. Помимо тонкого кишечника, РВ обнаруживают в легких и мезентериальных лимфоузлах больных телят. Вирус поражает цилиндрические эпителиальные клетки ворсинок тонкого кишечника, размножаясь в эндоплазматической сети этих клеток и

Глава 1. Family Reoviridae Реовирусные инфекции вызывая их гибель и десквамацию. Отмершие клетки заменяются неинфицированными кубическими клетками из крипт. Эти клетки не имеют рецепторов к РВ. Пораженные вирусом эпителиальные клетки выделяются с фекалиями в первые 4-5 ч от начала диареи, вирус обычно выделяется с фекалиями в течение 23 дн, а у животных диарея обычно длится на 3-7 дн дольше, чем выделяется вирус во внешнюю среду. При естественной инфекции среди новорожденных удается выделить вирус из фекалий клинически здоровых телят через 30-40 дн после болезни. Методом ВИЭФ обнаружен ротавирусный АГ в фекалиях клинически здоровых телят в возрасте от 6 нед до 3-х мес. Есть сообщение о выявлении комплексов PB-Ig у здоровых животных, что указывает на субклиническую форму инфекции, и иа то, что такие животные могут быть источником заражения новорожденных телят (4, 5).

Антигенная активность. В организме, пораженном РВ, главную роль играют АТ, продуцируемые слизистой оболочкой кишечника. В опытах на безмолозивных телятах с фистулами тощей кишки показано, что в ней АТ появляются между 3-м и 12-м дн, а в фекалиях - между 4-м и 18-м дн после инфицирования телят РВ. АТ в фекалиях телят выявляли в период от 25 до 58 дн после заражения. Реинфекция их через 5-70 ди после первичной инфекции обычно приводила к вторичному иммунному ответу.

У разных телят наблюдается значительное различие в сроках и количестве продукции кишечных АТ. В жидкости из тощей кишки выявляли АТ классов IgA, IgG и IgM. У большинства больных телят преобладали IgG. У телят, зараженных per os в возрасте 8-10 дн, вирус обнаруживали в фекалиях 1-3 дн. Интересно, что АТ появлялись в тонком кишечнике на 2-12-й день, т е. раньше, чем в фекалиях (на 4-8-й день). Из фекалий они исчезали через 30-60 дн. Вследствие кратковременной секреции АТ в кишечнике возможности локальной (per os) иммунизации ограничены. РВ-АТ выявлены и в секретах молочной железы; они также принадлежали к IgG и в меньшей степени к IgG 2, IgA и IgM, а в сыворотке крови после иммунизации коров живой культуральной вакциной они распределялись между IgG и IgG 2. Показано, что в ответ на экспериментальное заражение и прививку живой вакциной первыми выявлялись АТ класса IgM, которые в дальнейшем всегда заменялись АТ класса IgG. Во время проявления клинического симптома диареи у больных телят в тонком кишечнике и крови выявлялся интерферон. РВ не вызывают внутриутробной инфекции, но иммуноглобулины могут пассивно передаваться плоду через неповрежденную плаценту, поэтому антитела против ротавирусного белка обнаружены в сыворотках эмбриона КРС.

Антигенная структура. Все РВ имеют общий внутренний АГ, выявляемый в РСК, ИФ, РДП и иммуноэлектронной микроскопией.

Культивирование. РВ КРС размножается в культуре клеток (вначале первичной культуре клеток трахеи эмбриона КРС). Вирус вызывает специфическое ЦПД во вторичной культуре ПЭК через 3-7 дн после заражения. При высокой множественности заражения вызывает появление очагов серповидных клеток без разрушения клеточного монослоя. Сначала в клетках монослоя появляются мелкие гранулы, которые постепенно увеличиваются в размере. Поражённые клетки не отделяются от стенок пробирок. Инфекционный титр вируса (шт.Линкольн) в 2-6-сут культуре 3,5-4,2 lg ТЦД50/0,1 мл. При низкой множественности заражения изменения заражённой культуры ничем не отличаются от изменений, наблюдаемых при старении незаражённых культур. Поэтому для обнаружения вируса в заражённой культуре используется прямой метод ИФ.

Недавно показано, что данный вирус размножается в первичной культуре почек обезьян (макак-резус и зелёных мартышек) и однодневных поросят. К РВ (изоляту Cody) нечувствительны перевиваемые клетки почки хомяков ВНК, VERO, Lik-MK2, HeLa и кишечника. В культуре клеток почки эмбриона КРС к 18 ч титр клеточно ассоциированного РВ достигал максимальной величины и оставался высоким до наступления следующего цикла размножения. Циклы репродукции рео- и ротавирусов были сходны. Интерферон вырабатывался клетками, заражёнными вирусом, обработанным УФ лучами и активным вирусом. При 56°С активность интерферона несколько снижалась в течение 2

ч, исчезала при pH 12,5 в течение 48 ч.

Помимо первичных культур РВ КРС культивируют в перевиваемых клетках почки телят, МДВК, L, Vero, Ма-104 при 37°С в течение 7 дн. Перевиваемые культуры клеток МА- 104, ZZC-MK2 (BSC-1 и CV-1) и Madin-Darby оказались высокочувствительными к РВ КРС. К вирусу (изоляту Cody) нечувствительны перевиваемые клетки почки хомяков ВНК, Lie-MK2 и HeLa. При культивировании РВ лучшие результаты получают при добавлении в поддерживающую среду трипсина 5-10 мкг/мл. Полагают, что действие трипсина состоит в диспергировании вирусных агрегатов, повышении проницаемости клеточных мембран, а также инактивации интерферона. В составе вирионов происходит протеолитическое расщепление крупного полипептида VP3 на два полипептида VP5 и VP8 и повышение инфекци- онности самого вируса. Кроме того, при обработке РВ КРС трипсином в концентрации 1 мкг/мл титр его возрастает почти в 45 раз. Для всех РВ обработка трипсином неочищенных или высокоочищенных препаратов вируса приводит к увеличению инфекционности (в среднем в 4,2 раза). Показана способность бляшкообразования РВ КРС в клетках BSG-1 при добавлении в агаровую среду 4-10 мкг/мл трипсина и 25 мкг/мл ДЕАЕ-декстрана. В отсутствии трипсина бляшки не образуются. Шт. BSG-1 и CV-1 в присутствии 5 мкг/мл трипсина образуют бляшки, которые более четко контурируются при введении в покрытие 4%-ой нормальной куриной сыворотки. Размер бляшек может служить маркером для аттенуированных штаммов и титрования их. РВ КРС различаются не только по РНК-сегментам и РТГА, но и по размеру бляшек, индуцируемых в культуре клеток (23).

При этом клетки культуры ткани в присутствии сыворотки кур не отслаивались под действием трипсина. Описана дифференциация 2-х серологически родственных штаммов РВ телят: UK и NJ - по морфологии бляшек в культуре диплоидной линии клеток почки теленка и в PH (27а). Размножение вируса в клетках СПЭВ сопровождается слабым ЦПД. Репликация вируса в роллерной и стационарной культурах зависит от наличия трипсина в питательной среде. В роллерной культуре титр вируса был в 100 раз выше, чем в стационарной (2). При длительном пассировании РВ nrr.Reims 18/77 в культуре почечных клеток в присутствии специфических АТ получен АГ измененный вариант. Видимо, подобный дрейф может происходить и в естественных условиях под воздействием АТ, содержащихся в молозиве.

Гемагглютинирующие свойства. Обусловлены наличием ГА на поверхности интакт- ных вирионов. Гемагглютинация не происходит с вирионами, у которых отсутствует внешний капсидный слой. ГА нестабилен, при 22°С его активность за 24 ч снижается на 50%, при 45°С он инактивируется за 2 мин. С эритроцитами морской свинки ГА-тнтр вируса достигает 1:64. Было показано, что этот вирус агглютинирует эритроциты 0 группы человека в разведении 1:256. Однако штаммы РВ, выделенные от больных диареей телят в Англии, не агглютинировали эритроциты морской свинки и человека.

Гемадсорбирующие свойства - не установлены. У новорожденных телят заражение РВ сопровождается продукцией интерферона.

Экспериментальная инфекция. У телят-гнотобиотов, заражённых РВ (per os), через 12-14 ч наблюдают депрессию, анорексию, диарею. Если в жидких фекалиях не было E.coli, телёнок через 24 ч выздоравливал, а при наличии E.coli 50% телят погибало. В естественных условиях РВИ у телят протекает гораздо тяжелее, чем при эспериментальном заражении. Вирус в фекалиях появляется через 1-2 дня после заражения и выделяется в течение месяца. ВНА обнаруживаются в крови на 7-й день и достигают максимума через 4 нед после заражения (17). Клинически выраженную болезнь удается воспроизвести на телятах, свободных от специфических патогенных агентов, и на телятах-гнотобиотах, не получающих молозива. Для заражения используют фекалии, очищенные ультрацентрифугированием и Глава 1. Family Reoviridae Реовирусные инфекции проверенные под электронным микроскопом на присутствие вирионов РВ. У телят- гнотобиотов, зараженных РВ (per os), через 12-24 ч наблюдают депрессию, анорексию, диарею. Если в жидких фекалиях не находят E.coli, то теленок обычно через 24 ч выздоравливает, при наличии E.coli до 50% телят погибают.

После экспериментального заражения вирус размножается преимущественно в эндо- плазматическом ретикулуме, а вирусный АГ обнаруживается в эпителиальных клетках тонкого кишечника (замороженные срезы) или в фекальных смывах методом ИФ. Вирионы обычно обнаруживают в эндоплазматических скоплениях высоких бокаловидных эпителиальных клеток сегментов кишечника. Ультраструкгурные изменения клеток отмечают редко. Макрофаги, содержащие вирионы, обнаруживают только в тощей кишке телят 5-6 и 10 дн возраста. Новорожденные телята оказались чувствительны и к РВ кроликов. Они в возрасте 4-5 нед заболевают и погибают (4, 5). В 1974 г. впервые была показана серологическая связь между РВ телят и человека. Они имеют общий АГ, выявляемый в РСК, установлено родство РВ телят, свиней, жеребят и кроликов (в РСК, РИФ и РДП). Группоспецифические АГ этих вирусов локализованы во внутреннем капсиде РВ (30,31). РВ КРС WC3, шт. W179-9 индуцировал политипический АТ ответ у детей раннего возраста (4).