ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

Спектр патогенности в естественных условиях. В естественных условиях ПВИСоб может наблюдаться у собак всех возрастов, однако чаще у щенков до 6-мес возраста, установлен у куниц и енотовидных собак. У 2-15-нед щенков куниц и енотовидных собак заболевание появляется чаще и летальность достигает 30%. Норки, красные лисицы, еноты, скунсы нечувствительны.

ДИАГНОСТИКА

Предположительный диагноз на ПВИСоб ставят на основании клинических, патологоанатомических и эпизоотологических данных. Для подтверждения диагноза проводят лабораторные исследования. Наличие вируса может быть установлено с помощью ЭМ в свежих фекалиях от больных животных. Непрямым методом диагностики может служить постановка РГА вируссодержащего материала с эритроцитами свиньи или африканской зеленой мартышки. Кроме указанных методов перспективным может оказаться РТГ А.

Выделение вируса.

Взятие и подготовка материала. В лабораторию направляют пробы фекалий от больных животных в первые дни заболевания и сыворотку крови (при возможности парные сыворотки крови). От погибших животных - сердечные мышцы и тонкий кишечник. Подготовку материала проводят общепринятыми методами.

Заражение культур клеток. Для выделения вируса используют высокочувствительную перевиваемую культуру клеток А-72, полученную из подкожной опухоли собаки. Вирусный АГ в культуре клеток выявляют в ИФ. Помимо того, в инфицированной клеточной культуре через 4-5 дн вирус образует бляшки диаметром 0,4-1,5 см (12). По данным других исследователей, испытуемым материалом (гомогенат ткани кишечника, селезенки, почек и печени) заражают культуру клеток CrFK.

Индикация вируса ЭМ и ИЭМ. Наиболее быстрое подтверждение клинического диагноза получают при исследовании проб фекалий под электронным микроскопом или методом ИЭМ. Пробы фекалий получают при остром течении болезни. Вирус обнаруживают в 48,3% случаев. Также обнаруживали многочисленные частицы вируса в ядрах эпителиальных клеток крипт кишечника. В препаратах наблюдали или несколько вирусных частиц, или большие группы вируса характерной морфологии и размера. Методом ИЭМ выявлены большие агрегаты частиц, окруженных АТ (30). В прямой и ИЭМ референс-сыворотку разводят 1:10 и 1:50. При ИЭМ используют антисыворотку к ПВ кошек. Методом негативного контрастирования также удается быстро диагностировать ПВ-миокардит собак, исследуя суспензию гомогената сердечной мышцы (18).

Серологическая идентификация вируса

РГА. Наиболее часто используется в диагностической практике. Для этой цели берут фекалии в первые дни заболевания (1-4-й дн), так как позднее уже образуются АТ; готовят гомогенат на забуференном физрастворе с pH 6,6-6,8 в соотношении 1:5, центрифугируют при 3-5 тыс. мин1 (лучше 8-10 тыс. мин'1). Надосадочную жидкость используют в РГА. Последнюю ставят на том же забуференном р-ре с эритроцитами свиней (0,5-1%-ная взвесь) при 2-4°С. Учет производят через 1-1,5 ч. Необходимо выбрать донора эритроцитов, так как около 30% эритроцитов свиней обладают спонтанной агглютинацией (6). Для выявления ПВС предложена гемагглютинация с формалинизированными эритроцитами свиней (35). Во \ время пика болезни в РГА исследуют пробы фекалий и сыворотки крови.

ИФ. В качестве высокоточного и специфичного теста предложена ИФ мазков-; отпечатков слизистой оболочке кишечника (8). Описана методика ускоренной диагностики j на основе НИФ (39). В ИФ идентифицируют ПВС, выделенный в культуре клеток.

РТГА. Ее ставят общепринятым методом в микро- и макровариантах с 4-8 ГАЕ вируса j при 4°С. Используемые сыворотки инактивируют 1 ч при 56°С и обрабатывают эритроци- ] тами свиней (на 1 мл сыворотки 2-3 капли осадка эритроцитов, выдерживают при периоди- 1 ческом встряхивании 2 ч при 4°С, затем центрифугируют 10 мин при 1000 мин'1). Далее ] сыворотки обрабатывают каолином (25%-ную суспензию каолина на забуференном р-ре pH \ 6,6-

6,8 добавляют в равном объеме к сыворотке, выдерживают 30 мин при комнатной тем- : пературе, периодически встряхивая, затем центрифугируют), после чего их используют в j РТГА. Если стандартная гипериммунная сыворотка нейтрализует ГА-активность вируса в j разведении 1:8 или 1:16, результат считают положительным (6). РГА с последующей РТГА : дают возможность быстро и точно поставить диагноз.

РНГА. РНГ А предложена для выявления и идентификации вируса в фекалиях больных собак. Пробы фекалий, суспендированных в 10%-м барбигаловом буфере, центрифугировали 15 мин при 2000 мин'1, а надосадочную жидкость - при 4000 мин'1 также 15 мин (14).

ИФА. Чувствителен и специфичен при диагностике ПВИС (56). С помощью метода сэндвич-ELISA удается обнаруживать парвовирусный антиген в фекалиях собак (41).

Идентификация с помощью монАТ. Применяя их C.Parrish и др. получили доказательства небольшого АГ различия между ПВС, вирусами энтерита норок и панлейкопении кошек, а также между 2-мя последними вирусами (45).

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. В сыворотке крови щенков через 4 дня после появления клинической картины болезни титры анти-ГА колебались от 1:5000 до 1:16000, что свидетельствовало о наличии быстрого АТ ответа на ПВИС (60). По данным Klingeborn и др. (30) при остром течении болезни титр анти-ГА составлял 1:320- 1:20480. Обычно сыворотки крови в РТГА считают положительными начиная с разведения 1:160 и выше. Через 4-7 дн после заражения у инфицированных собак в сыворотке крови в высоком титре обнаруживали ВНА и тормозящие гемагглютинацию АТ, уровень которых практически не снижается в течение 2 лет (3). Для серологической диагностики ПВИСоб используют шт. SP-80, размноженный в культуре легочных клеток кошки. В реакции обычно используют эритроциты свиней, фиксированные 3%-ным р-ром формальдегида. Разбавителем для эритроцитов, АГ и сыворотки служит 0,01 М р-р фосфатного буфера, pH 6,8, содержащий 0,1% бычьего сывороточного альбумина. Неспецифические анги-ГА удаляют прогреванием сыворотки 30 мин при 56°С и адсорбируют свиными эритроцитами (42). У реконвалесцентов титр анги-ГА 1:1280-1:2560 обычно держится около года и такие животные иммунны к повторному заражению.

РНГА. В 70% случаев уровень титров АТ составлял 1:256-1:4098 (14).

PH. Ее чаще ставят в культуре клеток почки котенка, результаты учитывают ИФ, поскольку вирус не проявляет ЦПД. Чувствительности и воспроизводимости достигают, используя для постановки стандартный ПВСоб, имеющий низкое отношение Г А единиц к инфекционным (флюоресцирующим) единицам (61).

ВИЭФ, Применяют для выявления АТ. Линии преципитации образуют все сыворотки с титром в РТГА 1:40 и выше, причем с помощью ВИЭФ АТ обнаруживают чаще, чем в РТГА. Метод оказался ценным тем, что позволил выявить ПВСоб АТ в экстрактах фекалий, причем дополнительной обработки экстрактов, необходимой при постановке РТГ А, в этом случае не требуется (52).

Твердофазный ИФА (ELISA). С его помощью у щенков можно выявлять материнские АТ и определять уровень поствакцинальных АТ (21).

Дифференциальная диагностика. ПВИСоб следует дифференцировать от алиментарного и паразитарного гастроэнтеритов, чумы, при которой бывает очень высокая температура тела, конъюнктивитов, ринитов и поражений ЦНС. Кроме того, ее следует отличать от вирусного гепатита и короиавирусной инфекции собак.

ИММУНИТЕТ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА

Для профилактики ПВИС успешно используются гетерологические, аттенуированные или инактивированные вакцины против панлейкопении кошек (48).

Инактивированные вакцины. Применяют вакцину из ПВ-иггамма кошек. В Канаде применяют формолвакцину с двойным адъювантом (гидроокись алюминия и адъювант L- 80), с вирусом, выращенным в культуре перевиваемых клеток почки кошки (50). Формолвакцину готовят из шт. CPV-916, репродуцированного в любой чувствительной культуре клеток (почек собак, кошек, легких норок). Показано, что иаилучшая защита щенков обеспечивается 3-кратной иммунизацией инактивированной вакциной. Предложены ГОА формолвакцина из аттенуированных штаммов инфекционного энтерита кошек и геморрагического энтерита собак, а также метод проверки ее активности на курах (15). В Англии применяют инактивированную комбинированную вакцину CPV-2, содержащую ПВС.

Живые вакцины. Применяют живые модифицированные вакцины, приготовленные из аттенуированного штамма ПВСоб или вируса панлейкопении кошек. Живые вакцины надежнее. После 2-кратиого применения у 92% привитых собак иммунитета обеспечивается до года. Их можно применять на щеиках, имеющих высокий уровень колостральных АТ (43). Гетерологичная вакцина представляет собой препарат, приготовленный из вируса панлейкопении кошек шт. Леопард, хорошо размножающегося в культуре клеток собак ССЛ-64. Живая вакцина из модифицированного вируса панлейкопении кошек обеспечивает у собак устойчивый иммунитет продолжительностью не менее 1,5 года. Живая аттенуированная вакцина (73) была получена в результате 80 серийных пассажей ПВСоб в культуре клеток почек собак (шт. С-780916). Аттенуированный крупнобляшечный вариант этого штамма оказался апатогенным для щенков, не вызывал инфекцию плодов и в настоящее время успешно используется в США в качестве живой вакцины. В Австралии ПВС-2, выделенный при ПВИС, был аттенуирован путем культивирования в почечных клетках кошки (FK) и собаки (МДСК). Вирус клонировали методом конечных разведений и на уровне 69-го пассажа депонировали в коллекции клеточных культур как № 890426016, а также как шт. CPV-2 Р69, и использовали для приготовления вакцины в культуре клеток FK. Вакцииа слабопатогенна и индуцировала иммунный ответ у щенков, имеющих материнские АТ (10).

В настоящее время фирма Смит Кляйн выпускает вакцину Foll-cell для иммунизации собак против ПВИСоб. Вакцина содержит ослабленный вирус панлейкопении (энтерита) кошек. В Англии выпускается ассоциированная вакцина "Calaxy IV", предохраняющая собак от чумы, аденовируса I (гепатита), II типов и параинфлюэнцы. В основе этого препарата используют высокоиммуногенный вирус кошачьей панлейкопении. Во Франции успешно применяется 5-валентная вакцина против лептоспироза, чумы, контагиозного гепатита, бешенства и ПВИСоб (17). В Венгрии используют живую вакцину Parvoven из апатогенного вируса. Препарат ареактогенен для щеиков любого возраста. У щенков старше 3 мес по- ствакцинальный иммунитет сохраняется не менее года. Рекомендуется вакцинировать щенков в городах в возрасте 9-12 нед, а в собаководческих хозяйствах - в возрасте 6 и 9-12 нед, в инфицированном поголовье еще и в возрасте 16 нед. При наличии у щенков материнского иммунитета предпочтительнее применять вначале убитую вакцину, а затем живую. Иммунитет начинает выявляться через неделю после вакцинации и достигает максимума на 10- 14-й дн (7). Получена субъединичная вакцина, которая содержит белок VP2, продуцируемый при репликации рекомбинантного бакуловируса в клеточной культуре насекомых или насекомых, которые являются пермиссивными хозяевами для размножения соответствующих бакуловирусов (54, 64).

Разработан метод интраназальной вакцинации щенков с материнскими АТ живым модифицированным ПВС шт. CPV-17-80 jss. Щенков от вакцинированных матерей прививали 1-

й раз в 4-нед возрасте и далее каждые 2 нед до достижения 11-нед возраста. Иммунологическую эффективность вакцинации определяли в РТГ А в сыворотках крови, полученных перед каждой вакцинацией. Показано, что иммунный ответ зависел от исходного уровня материнских АТ: при исходном уровне в 40 ед. иммунологическая эффективность составляла 100%, при титре 80 ед. - 72,2 и при титре 160 ед. - 17,6% (10).

Эффективно применение специфической иммунной сыворотки при лечении ПВИСоб у щенков (27). Для получения такой сыворотки клинически здоровой собаке, имевшей в крови анти-ГА против ПВС в титре 1:512, дважды с 2-нед интервалом вводят внутривенно по 2105 ТЦД50 ПВСоб. Кровь для приготовления сыворотки берут через неделю после 2-й инъекции ПВС, когда титр АТ в РТГА в крови собак достигает 1:8192. Полученную сыворотку инактивировали при 56°С 30 мин, фильтровали через фильтр с диаметром пор 450 им и контролировали на авирулентность с использованием культуры клеток. У всех щенков, экспериментально инфицированных ПВС и проявивших признаки ПВИС после инъекции 2 мл иммунной сыворотки, наблюдали лишь легкую форму болезни с последующим полным выздоровлением. Среди инфицированных щенков, которым сыворотку не вводили, отмечено тяжелое течение ПВИСоб с геморрагической диареей, сопровождающейся гибелью половины больных щенков. Прн естественном течении ПВИСоб у щенков после применения иммунной сыворотки наблюдали, как правило, быстрое выздоровление.

Разработана субъединичная вакцина против ПВИСоб и других родственных вирусов (EPL, MEV). Для этого получают рекомбинантный белок VP2 ПВСоб посредством репликации рекомбинантного бакуловируса, содержащего ген этого белка. Полученный таким образом белок VP2 способен образовывать пустые химерные капсиды с высокой иммуногенностью. Кроме того, в белки можно вводить эпитопы других вирусных белков (методами химической или генетической инженерии) и использовать их для приготовления поливалентных вакцин (20). Синтетическая пептидная вакцина также защищала собак против вирулентного ПВСоб (31).

Серологическая оценка поствакцинального иммунитета. Основными реакциями для обнаружения поствакцинальных АТ являются РТГ А и PH.

Длительность циркуляции поствакцинальных АТ. После применения аттенуированной вакцины у собак со 2-го дня появлялись анти-Г А, уровень которых достигал максимума к концу 1-й нед (13). После вакцинации живой вакциной ВНА обнаруживали в максимальном титре в течение 6 мес (29). Спустя 3 дн в крови вакцинированных щенков титр ВНА был 1:20, к 21-му дню он достигал максимума (1:1042) и спустя 114 дн средний титр составлял 1:64 (23).

Связь титров АТ с резистентностью. Установлена прямая корреляция между титрами АТ и устойчивостью щенков к экспериментальному заражению. Невосприимчивость их к ПВС, имевших после вакцинации титр анти-ГА >1:80, сохранялась более 1 г (47). Иммунитет обусловлен наличием анти-ГА в титре >1:80, которые сохранялись не менее 2-х лет (13). Однако наличие, колостральных специфических АТ, которые сохраняются в крови до 13 нед, снижает эффективность вакцинации щенков живыми вакцинами (9). Так, вакцина у серонегативных щенков индуцировала иммунитет более чем у 90%, при наличии титров 1:10 - более 95%, при титрах 1:20 - только у 50%, а при титрах перед вакцинацией >1:80 ни одно из животных не приобрело активного иммунитета (9). Защиту щенят от ПВИСоб до 4-мес возраста обеспечивает материнский иммунитет. Щенки получают АТ с молозивом, колост- ральные АТ подавляют репродукцию вакцинного вируса, в связи с чем щенков рекомендуется вакцинировать не ранее 4-х мес после рождения (12).

Связь титров АТ с вирусоносительством и вирусовыделением. Обстоятельно этот вопрос не изучен, однако известно, что собаки с титром АТ 1:80 и выше после перорального введения им вируса в количестве 10б ТЦД50 не заболевают и не выделяют его с фекалиями. Сообщалось о наличии у собак, выделяющих ПВСоб, состояния иммунодепрессии (4). Иммунная реакция на ПВСоб включает и секреторный компонент слизистой оболочки кишечника и системный компонент периферической лимфоидной ткани. Поэтому эффективная вакцина должна стимулировать как местный, так и системный иммунитет (44).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1.Анохина Ю. Ветеринария 1982, 6. 2.Демкин Г.П. и др. Диагн. и проф. бол. животных, Саратов,1992 :67. З.Орлянкин и др. Репродукция вирусов жив., 1985. 4.Петров В.Ф. и др. Комплексная вакцинация, Кировобад,1983 :179. 5.Симонович В.Н. и др. Ветеринария, 1991, 2 :65. б.Сулимов А. А. и др. ПВ энтерит собак, 1984. 7.Bartha A. Allotow Kozl, 1990, 26, 7, 4, 8 :97. 8.Bergmann V. et.al. Arch exper Vet Med, 1983, 1 :127. 9.Buonavoglia C. et.al. Clin Veter 1985, 108, 1:19. lO.Bounavolgia C. et.al. J Vet Med, 1994, 41, 1 :3. 11. Carmichael L.E. et.al. Cornel Vet, 1981, 71, 4: 408. 12.Carmichael L.E. et.al. Adv Vet Sci and Comp. Med. 1981, 25, 1:37. 13.Burtsober H. Wien tierarztl Monatsschr, 1983, 70, 3: 93. 14.Celer V. et.al. Vet Med ,1984, 29, 6 :373. 15.Churchell A.J. Biol. Scand 1982, 10, 1:1. 16.Compagnucci M. et.al. M Bull Assoc Ital vet picollianim, 1985, 24 :215. 17.Davoust B. et.al. Rev Med Veter, 1985, 136, 5: 363. 18.Enihan P. et. al. Vet Res 1980, 107, 9 :201. 19.Engster A.K. et.al. J Am Vet Med Assoc, 1978, 173, 10 :1340. 20.Европ. патент ЕЮ 554414A1, 1994, 15 :8. 21.Fascus S.A. et.al. Am J Vet Res 1985, 46, 4 :859. 22.Flehmig B. et.al. J Med Virol 1987, 22 :7. 23.Fulker R.H. et. al. Med vet Pract 1982, 63, 2 :155. 24.Goto H. et.al. Jap J Vet Sci, 1984, 46, 5 :729. 25.Goto H. et.al. Jap J Vet Sci, 1984, 46, 4: 519. 26.Hirosava T. et.al. Jap J Vet Sci 1985, 47, 1 :89. 27Ishibeshi K. et.al. Jap J Vet Sci 1983, 45, 1: 59. 28.Johnson R.H. et.al. Vet Quart, 1983, 5, 2 :86. 29.Kahn D.E. et.al. Vet Med smoll Animal Clin. 1983, 78, 11 :1739. 30.Klingeborn B. et.al. Zbl Vet Med Reihe B, 1980, 27 :483. 31. Langeveld J.B.M. et.al. J Virol 1994, 88, 7 :4506. 32.Lenghans C. et.al. Austral Vet J 1980, 56, 10 :465. 33.Macartney L. et. al. Vet Res 1984, 115, 9

:201. 34.Macartney L. et.al. Vet Res 1984, 115, 18: 453. 35.Mathys A. et.al. Am J Vet Res 1983, 44, 1 :150. 36.McCarthy G. Irish Vet J 1980, 34, 2 :15. 37.Mcgavin D.R. et.al. Pat 633349, Австралия, № 61523/90, заявл. 08. 08. 92. 38.Mengeling W.L. Amer J Vet Res, 1983, 44, 5: 865. 39.Mess J. Tierarztl Praxis 1984, 12, 3 :427. 40.Meunier P. C. et.al. Vet Pathol 1984, 21, 5 :509. 41.Mildbraid M.M. et.al. Amer J Vet Res 1984, 45, 11: 228. 42.Mohry Sh. et.al. Jap J Vet Sei 1982, 44, 3 :354. 43.Moore D.J. J S Afr Vet Assoc 1983, 54, 4 :259. 44.Nara P.L. etal. Amer J Vet Res 1983, 44, 11: 1989. 45.Parrish C.R. et.al. Arch Virol, 1982, 72, 4 :267. 45a.Parrish C.R. et.al. Virology, 1988, 166, 2 :293. 46.Pastoret P.P. Ann Med Vet, 1984, 128, 6 :473. 47.Pollock Roy V. et.al. Am J Vet Res 1983, 44, 2 :169. 48.Postoret P. et.al. Ann Med Vet 1980, 24, 2 :89. 49. Potgieter L. N. D. et.al. Can J Comp Med, 1981, 45, 3: 212. 50.Povey C. Can Vet J 1982, 23, 1: 15. 51.Rimmetzwaan G.F. et.al. Vet Quart 1990, 12, 1 :14. 52.Sehwers A. et.al. Ann Med Vet 1980, 124 :255. 52a.Siegl G. Parvoviruses., New York, London, 1984 :362. 53.Senda M. etal. Vet Microbiol 1986, 12, 1 :1. 54.Soliki J.T. et.al. J Gen Virol, 1992, 73, 2 :369. 55.StannS.E.et.al. J Amer Med Assoc, 1984, 185, 6 ;651. 56.Teramoto Y.A. J Clin Microbiol 1984, 20, 3 :373. 57.Tratschin Jon-Duri etal. J Gen Vinl, 1982, 61,1 :33. 58.Uvatoko K. et.al. Vet Microbiol, 1995, 43, 4 :315. 59. Waldvogel A.S. et.al. J Vet Med В 1991, 38, 5: 353. 60.Walker S.T. et.al. Austral Vet Pract 1979, 9, 3 :151. 61.Wallace B.L. et.al. Cornel Vet 1983, 73, 1 :52. 62.Weissenbock H. et.al. J Vet Med 13. 1991, 38, 7 :481. 63.Wierput M. Proccelings, 1983 :560. 64.Wood H.A. et.al. Boyce-Thompson Inst, for Plant Res inc; Cornell Res. Foundation, Inc. N 191684, 09. 05. 1988, опубл 20.11.1990. НКИ 424/88.