ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

Предполагают, что в странах Африки антилопа гну является латентным носителем вируса ИРТ. Помимо того, вирус может реплицироваться в клещах, которые играют важную роль в возникновении заболевания среди КРС. ДИАГНОСТИКА

ИРТ диагностируют на основании клинико-эпизоотологических данных, патологоанатомических изменений в органах и тканях с обязательным подтверждением лабораторньми методами. Латентную инфекцию устанавливают только лабораторньми исследованиями. Лабораторная диагностика включает: 1) выделение вируса из патологического материала в культуре клеток и его идентификацию в PH или РИФ; 2) обнаружение АГ вируса ИРТ в патологическом материале с помощью РИФ; 3) выявление АТ в сыворотке крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в PH или РНГ А. Для лабораторной диагностики ИРТ используют набор диагностикумов ИРТ КРС и набор эритроцитарного ди- агн ости кума для серодиагностики инфекции в РНГ А.

Диагностику ИРТ проводят параллельно с исследованием материала на ПГ-3, аденовирусную (1 и 2), PC-инфекции и ВД-БС. Схема проведения лабораторной диагностики ИРТ аналогична применяемой при диагностике аденовирусной инфекции. Предварительный диагноз на ИРТ КРС ставят на основании положительных результатов обнаружения АГ в патологическом материале РИФ с учетом эпизоотологических и клинических данных, а также патологических изменений.

Выделить вирус из носовой полости, влагалища и с конъюнктивы удается с 5-го по 10-й дн, а ВНА - с 5-8-го дня после заражения. Более высокий титр АТ наблюдается после 35 дн, затем начинается медленное снижение. Для выделения вируса ИРТ из бразильской спермы использовали 2 линии перевиваемых клеток МДВК и метод непрямой ИФ (67). Установлено, что максимальное количество вируса выделяется во время подъема температуры тела на 4-

7-й дн болезни и продолжался до 10-14 дн (8).

Индикация вируса

Обнаружение специфических телец-включений. В ядрах клеток эпителия пораженных слизистых оболочек носовой полости, вульвы, вагины и конъюнктивы находят специфические тельца-включения. Через 18-20 ч после заражения их можно обнаружить в клетках культуры, окрашенной гематоксилин-эозином.

Выделение вируса. Вирус выделяют в культурах клеток почек телят, почек эмбрионов телят, тестикул бычков. В настоящее время для выделения вируса ИРТ используют 2 линии клеток МДВК. Эти клетки активно синхронизируются ловастатином (лекарство для лечения гиперхолинестерии у людей). У синхронизированных клеток экспрессия генов ГВ-1 КРС не зависит от фазы клеточного роста (70). В этой линии клеток выделяли вирус из бразильской коммерческой спермы с признаками ЦПЭ и подтверждением методом прямой ИФ (67).

Экспресс-методы индикации. В ранее опубликованных работах (72, 73) для обнаружения вируса ИРТ применен метод молекулярной гибридизации с использованием радиоактивно меченых ДНК-зондов. Однако более перспективным является применение нерадиоактивного метода детекции вирусной ДНК.

Серологическая идентификация

ИФ. Техника постановки её такая же, как и при диагностике аденовирусной инфекции КРС. Обращают внимание на свечение АГ в цитоплазме и перинуклеарной зоне неповрежденных клеток. Ярко-зеленая флюоресценция в виде гранул или диффузного свечения цитоплазмы не менее чем в 10% клеток позволяет оценить препарат как положительный. Предварительный диагноз ставят при наличии не менее 30% положительных препаратов от общего количества исследованных проб. В мазках из влагалища и конъюнктивы специфическую флюоресценцию отмечали через 24 ч, из препуция - через 48, из носа и трахеи - через 72 ч после заражения. Присутствие специфического АГ удается подтвердить заражением культуры клеток почки телят, в которой обнаруживается специфическая перинуклеарная и диффузная цитоплазматическая флюоресценция, свойственная ИРТ.

Совпадаемость результатов ИФ и патологоанатомических изменений составляет 87%, а ИФ н вирусологических исследований - 44%. При параллельном исследовании сывороток в PH и РНГ А результаты совпадали в 94% случаев. В полевых условиях РИФ оказалась положительной в 18,5%, а метод вирусовыделения - в 15,9% случаев. РИФ можно использовать для экспресс-диагностики ИРТ с последующим подтверждением диагноза вирусологическими методами (6, 8).

PH. При наличии ЦПД в культурах клеток, зараженных изолятом, и положительной ИФ проводят окончательное типирование вируса в PH, которую ставят общепринятым методом в первичной культуре ПЭК или перевиваемой линии клеток МДВК. Результаты PH учитывают по ЦПД вируса, для чего определяют титр типируемого изолята в присутствии специфической и отрицательной контрольной сывороток. Титр рассчитывают по методу Рида и Менча и выражают в ТЦД50/МЛ. Затем вычисляют индекс нейтрализации. Видовую принадлежность изолята устанавливают при разности в титрах вируса не менее 2 lg; при разности нейтрализации от 1 до 2 реакцию считают сомнительной, в этом случае её повторяют; при разности нейтрализации менее 1 реакцию считают отрицательной. При положительных результатах PH изолят считают полностью идентифицированным (37).

РТГА. Ставят её микрометодом при 4°С с 0,5-1%-ной взвесью эритроцитов белых мышей, разбавитель - трис-буферный р-р с 0,2% БСА. В качестве АГ используют культуральную жидкость, которую концентрируют ПЭГ-6000 или ультрацентрифугированием (7).

ELISA. Иммунопероксидазный метод можно использовать для исследования прижизненно взятых нозофарингиальных мазков-отпечатков в клетках, полученных из носовых смывов. Кроме того, для лабораторной идентификации вируса ИРТ рекомендован непрямой антикомплементарный иммунопероксидазный метод НАИП (7). При световой микроскопии он обеспечивает четкое выявление вирусного АГ в цитоплазме инфицированных клеток в виде окрашенных в коричневый цвет образований, которые видны при увеличении в 140 раз.

Таким образом, НАИП является перспективным при диагностике острых респираторных вирусных инфекций КРС (7, 8). При использовании его для индикации вируса ИРТ в культуре клеток ПЭК АГ выявляется через 18-22 ч после заражения. Три прямых серологических метода быстрого обнаружения вирусных АГ (ИФ, ИФА и ELISA) одинаково применимы для обнаружения вируса во время лихорадки, но не на поздних стадиях болезни.

Идентификация с помощью монАТ антител. Иммунопероксидазный метод с использованием монАТ является более чувствительным и специфичным по сравнению с обычными методами выделения вируса. Помимо того, данный метод имеет преимущество в быстроте получения результатов (32). Быстрое подтверждение вируса ИРТ (инфекции) возможно методом культивирования его с последующим ИФА зараженной культуры с использованием монАТ (51). Проведена молекулярная характеристика южноамериканских изолятов герпес- вируса-1 (ИРТ) КРС с помощью монАТ и электрофореза в полиакриламидном геле с доде- цилсульфатом натрия (52).

Идентификация посредством рестрикционного анализа ДНК. Описаны методы клонирования фрагментов генома вируса ИРТ, выделение и характеристика рекомбинантного ДНК-зонда, которые позволяют определять вирус в клинических пробах. Усовершенствована гибридизационная тест-система, основным компонентом которой является биотинили- рованный 1-нитевый ДНК-зонд (1). С помощью метода дот-блот-гибридизации выявлена ДНК вируса ИРТ в пробах спермы, полученной от серопозитивных животных, когда выделение вируса в культуре клеток давало отрицательный результат. Хороший результат также получен при использовании инфицированных культур клеток.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. АТ к вирусу ИРТ можно обнаружить в сыворотках крови больных и переболевших животных в PH, РНГА и др. Для постановки ретроспективного диагноза используют парные пробы сывороток, взятые с интервалом в 3 нед. Результат серодиагностики учитывают по возрастанию титра АТ в парных пробах сыворотки, а также числа серопозитивных животных через указанный интервал (62).

PH. Ставят методом разведения испытуемых сывороток с постоянной дозой вируса в культуре клеток ПЭК или ТБ. Вирус предварительно титруют в культуре клеток. Зараженные и контрольные культуры инкубируют при 37°С, ежедневно учитывая ЦПД вируса, окончательный учет проводят на 5-7-е сут. Наибольшей чувствительностью обладает PH, основанная на 24-ч инкубации смеси вирус-сыворотка (7, 36). Титром вируса считают обратную величину его наибольшего разведения, вызывающего ЦПД в 50% культур, который высчитывают по методу Рида и Менча, или Кербера и выражают в ТЦДз0/мл. Титры 1:32, 1:64 обнаруживаются редко. В неблагополучных по данной болезни стадах ВНА выявляются у 12% клинически здорового скота. Ретроспективный диагноз на ИРТ ставят при 4- кратном и более приросте АТ в пробах сывороток реконвалесцентов. В настоящее время широко используют микрометод PH (7).

РНГА. Биологическая промышленность нашей страны выпускает эритроцитарный ди- агностикум. РНГА ставят согласно методическим указаниям в микропанелях с U-образными лунками наборов микротитрования Такачи или Титертек по общепринятой методике. Результаты РНГА с используемыми сыворотками оценивают по титрам; положительные -1:16 и выше, сомнительные - 1:8, отрицательные - 1:4, 1:2 и нулевые. Увеличение титров АТ в парных сыворотках в 2-4 раза свидетельствует о наличии инфекции (61). Применяя РНГА, можно обнаружить АТ в более ранний период инфекции, чем с помощью PH. Установлено соответствие результатов РНГА и PH в 95% случаев. Высокие титры чаще выявляли в РНГ А. С помощью данной реакции легче и быстрее, чем PH проводить типирование АТ к вирусу ИРТ. Титры АТ были в 7-10 раз выше выявляемых в PH (7).

РДП. Не нашла широкого применения в диагностической практике, хотя многие исследователи рекомендуют её использовать для серодиагностики ИРТ. Marchang (1982) считает, что диагностика по наличию ПА имеет ряд преимуществ по сравнению с PH: она проще и быстрее в постановке, чем PH. ПА обнаруживают вскоре после введения вируса в организм, но они быстро исчезают. По наличию ПА можно уловить недавно прошедшую инфекцию, в то время как ВНА длительно циркулируют в организме, и заболевание можно уловить толь ко по парным сывороткам (7). При выявлении ПА лучше всего брать пробы крови на 8-й и последующие дн болезни.

РТГА. Может использоваться для выявления и количественной оценки АТ к вирусу ИРТ. Титр анти-Г А коррелирует с титром ВНА (7). Положительный результат РТГ А уже в 1-ом разведении сыворотки (1:4) указывает на наличие АТ к вирусу ИРТ в данной пробе сыворотки. 4-кратный и более прирост титров анти-Г А в парных пробах сыворотки является показателем активной инфекции.

ELISA. Широко применяют в Нидерландах, США, Великобритании, Швеции, странах бывшего СССР. Он оказался пригодным для обнаружения АТ к вирусу ИРТ в молоке. Для этого достаточно получения проб смешанного молока от 5-10 коров. АТ определяют после предварительного концентрирования в них lg. Совпадаемость данных серологических реакций в пробах сыворотки крови и молока составляла 92,8%. С помощью данного метода можно оперативно определять иммунологический статус поголовья лактирующих коров целого региона, а также проводить обследование экспортируемых и импортируемых животных (24). В ФРГ разработан и применяется метод ТРАХИТЕСТ для ИФА проб сборного молока коров с целью диагностики скрытого вирусоносительства (7).

Предложен непрямой метод IgM-ELISA для определения недавней инфекции ИРТ. Ранние AT IgM выделены на 6-й дн после заражения, к 9-му дн происходил рост титра AT lg, а к 13-му дн - ВНА. У телят, привитых инактивированной вакциной, раннего иммунного ответа не происходило - AT IgM не выявлялись, a IgM и ВНА появлялись позже, чем после заражения. Однако при этом следует иметь в виду, что наличие в сыворотке КРС ревматоидного фактора может привести к ложноположительным результатам диагностики в IgM- ELISA. В этом случае предварительная обработка проб сыворотки антибычьими IgM позволяет избежать ложноположительных результатов. Тест IgM-ELISA имеет большую ценность в диагностике ИРТ, особенно у молодых животных. В группе позитивных сывороточных проб корреляция между ELISA и РНГА составляла 98,3%, a ELISA с ИФ - 95,7% (17).

ELISA с использованием монАТ. Основан на конкуренции между АТ сыворотки крови КРС и нейтрализующими мышиными монАТ. Для его проведения лунки микротитраци- онных панелей обрабатывают очищенным вирусом ИРТ, и после высушивания их можно использовать немедленно или хранить при - 20° С. В обработанные вирусом лунки панелей последовательно вносят неразведенную испытуемую сыворотку, специфические к вирусу ИРТ монАТ, конъюгированные пероксидазой, субстрат пероксидазы. Результаты реакции учитывают в спектрофотометре при А405. В случае положительной реакции связывание монАТ ингибируется АТ сыворотки крови. Метод оказался намного чувствительнее и специфичнее PH.

Аллергическая проба. Установлено, что при экспериментальном заражении наступает аллергизация организма, проявляющаяся положительной кожной аллергической реакцией уже на 7-й день после заражения, а при вакцинации живой вакциной это происходит через 2 нед после вакцинации, при естественном заражении (спонтанные аборты) аллергизация также наступает быстрее. В Болгарии и ФРГ применяют кожно-аллергическую реакцию для выявления переболевших и вакцинированных животных (8).

С целью унификации методов дифференциальной диагностики болезней, проявляющихся с везикулярным синдромом, получены высокоактивные препараты для идентификации возбудителей ИРТ и ВД КРС. Использование этих праймеров при вирусологической экспертизе патологических материалов оказалось особенно полезным при смешанном течении ящура и указанных болезней. Применение ранее разработанных для диагностики ящура методов изготовления специфических АГ и антительных препаратов дает возможность изготовления аналогичных по качеству диагностикумов при идентификации вирусов ИРТ и В Д и унификации для схемы дифференциальной диагностики основных болезней, протекающих с везикулярным синдромом и наиболее часто осложняющих диагностику ящура (41).