ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ

Многочисленные безуспешные попытки обнаружить и выделить его в инфекционной форме из опухоли или из органов больных птиц находились в противоречии с данными о высокой контагиозности этого заболевания. В 1969 г Calnek и др. (61) выявили вирусспеци- фический ИФ АГ в эпителии перьевых фолликул зараженных цыплят. Оказалось, что перьевые фолликулы - постоянное место локализации АГ в высокой концентрации. Одиако дерма и эпидермис кожи инфицированной птицы всегда свободны от вирусспецифического АГ. Пораженные клетки эпителия фолликулов, представляющие часть многослойного плоского эпителия, в результате слущивания отделяются в окружающую среду вместе с линяющими перьями и являются источником инфекции. В 1970 г. (63) выделили из этого источника инфекционный внеклеточный вирус и вызвали с его помощью заболевание у цыплят. Эта работу продолжили Nazerian и Witter (140). Они вызвали заболевание внеклеточными экстрактами перьевых фолликулов и доказали, что местом репликации полного инфекционного вируса является эпителий перьевых фолликулов. Позднее (46) для передачи инфекции использовали перхоть, собранную от инфицированных птиц.

Морфология и химический состав. Вирноны имеют кубический тип симметрии и форму икосаэдра. Вирус содержит 7% 2-нитевой ДНК. В ультратонких срезах культур зараженных клеток вирусные частицы под электронным микроскопом имеют диаметр 85-100 нм (Рис. 97), но иногда встречаются более крупные вирионы с оболочкой размером 150-170 нм. Они могут содержать электронно-плотный нуклеоид и располагаться большей частью в ядре. Различия в размерах комплексов обусловлено различием в углеводном компоненте (215)

. В отличие от развивающихся вирусных частиц, которые образуются в культуре клеток, вирусные частицы в клетках эпителия перьевых фолликулов являются осмиофильными включениями в цитоплазме клеток и состоят из электронноплотного материала (61, 170, 109). Число капсомеров 162, они представляют собой полые цилиндры длиной 9-12 нм. Кольцеобразный нуклеокапсид с подковообразной сердцевиной расположен между 2-мя частицами, сердцевина нуклеокапсида с палочкообразными структурами представлена 2-мя круглыми пересекающимися пластинками, края которых электронношютиые, а центр светлый. Морфогенез ВБМ в клетках перьевых фолликулов описаны И.П.Тыщенко (33,34,35).

Геном ВБМ представлен 2-мя уникальными последовательностями (Ц и Us) и целым набором прямых и инвертированных повторов (118). Секвенирован сегмент ДНК длиной 11286 п.и. вирулентного шт. С А ВБМ, содержащий всю область Us длиной 11160 п. и. Идентифицированы 11 открытых рамок считывания (ОРС), 7 из которых гомологичны генам альфагерпесвирусов (АГВ). Область Us шт. GA на 99% идентична ранее секвентированному сегменту (5255 п.и.) Us очень вирулентного шт. RBIB ВБМ. Полученные данные согласуются с предположением, что ВБМ относится к АГВ, а ие к гамма-герпесвирусам. (55а). С использованием полиаденилированной РНК из стабильно трансформированной ВБМ линии клеток МКТ-1 сконструирована библиотека кДНК и выделены кДНК, специфичные дня области короткого внутреннего повтора фрагмента ВатН1-А генома ВБМ. Секвенирование 5'- и 3'-концов выделенных клоиов позволило идентифицировать 4 класса к ДНК. Секвенирование и картирование этих к ДНК обнаружило семейство З'-котерминальных перекрывающихся транскриптов; некоторые из них сильно сплайсированы. Методом ПЦР амплифици- роваиы специфические области каждого класса к ДНК, клонированы и использованы дня получения рибозондов, которые гибридизируются с различными транскриптами во фракциях РНК, выделенных из литически или латентно инфицированных ВБМ клеток (133).

Изучены нуклеотидные последовательности генов тимидинкиназы 2-х герпесвирусов птиц: высокоонкогенного шт. БМ-RBJB и вакцинного - герпеса индеек FC-126. Кодирующие регионы представлены в 2-х генах 1029 и 1050 нуклеотидными последовательностями, что соответствовало полипептидам с 343 и 350 остатками аминокислот (178).

С помощью ПЦР из генома ВБМ были амплифицированы и клонированы ген gA, кодирующий предшественник секретируемого гликопротеина gp57-65 (А-АГ) и ген gB, кодирующий белок-предшественник гликопротеинового комплекса gpl00, gp60, gp48 (В-AT). Установлена нуклеотидная последовательность обоих генов, предсказана и проанализирована первичная структура белков, кодируемых этими генами (2,106).

Устойчивость. Устойчивость клеточно-свободного вируса к физическим и химическим факторам характеризуется следующими данными. Центрифугирование при 50 тыс. мин'1 осаждает вирус в течение 1 ч. В пределах pH 4-10 вирус чувствителен к эфиру. Многие месяцы он сохраняет вирулентность при -65°С, но при -20°С вирулентность его снижается через 4 мес хранения. В чешуйках кожи (перхоти) и размельченных сухих перьях больных птиц, хранившихся в условиях 28,5 - 41,5°С вирус, был активен в течение 55 дн. При контакте с этим вируссодержащим материалом у 40% здоровых цыплят уже через 8 иед. обнаруживались гистологические изменения, свойственные БМ. Следовательно, чешуйки кожи (перхоть) и сухие перья больных птиц могут быть источником инфекции в птицеводческих фермах. Schudel и др. (186) успешно заражали цыплят суспензией кожи кур, павших от БМ. Пыль, собранная в помещении, где содержались больные цыплята, сохраняла инфекционность в условиях комнатной температуры не менее 44 дн. Клеточно-свободный вирус, содержащийся в пыли курятника, патогенен для культуры клеток почек цыпленка и способен индуцировать опухоли в течение 1г. Клеточио-свободный, экстрагированный из пыли вирус остается патогенным при хранении в условиях -70°С, однако при -20°С 60% его инактивируется через 20 дн, а в условиях комнатной температуры - в течение 5 дн (99). Вирус выдерживает неоднократное замораживание, оттаивание и воздействие ультразвука в течение 10 мин. Полная термоинактивация клеточно-свободного вируса происходит при 4°С через 2 нед., при 20-25°С - через 4 дн, при 37°С - через 18 ч и при 60°С - за 10 мин. Птичий помет сохраняет инфекционность в течение 16 нед (198).

Хранение и консервирование вируса. Вирус сохраняется в клетках опухоли и культуры ткани при концентрации 50 106 кл./мл в контейнере, погруженном в жидкий азот. Кожу и эпителий перьевых фолликулов, содержащих клеточно-свободный вирус, сохраняют при температуре -20-60°С или лиофилизируют. Кровь больных цыплят при хранении в условиях 4°С остается вирулентной в течение 7 дн. При лиофилизации вируссодержащей крови ее патогенность падает. Надежное сохранение патогенных свойств вируссодержащей крови обеспечивается при добавлении к ней 5%-ного ДМСО в жидком азоте (-196°С) (119).

АГ структура. Она сложна. Основными гликопротеинами ВБМ являются А- АГ- (gp57- 65) и В- АГ- комплекс (gpl00, gp60 и gp49). В составе вируса БМ выявлено 6 АГ, из которых наиболее важные А, В, С. АГ А содержится во всех патогенных штаммах и при аттенуации утрачивается ими (78, 83, 217). АГ ВБМ содержит секретируемый гликопротеин с мол.м. от 57 до 65 кД в полностью гликозилированной форме. Этот АГ обнаружен в культуральной жидкости и экстрактах зараженных клеток, а В и С АГ - только в экстрактах зараженных клеток. Известно, что первоначально предшественник gA синтезируется как белок с мол.м. 47 кД, который после отщепления сигнального пептида дает белок-предшественник с мол.м. 44 кД (105). Функция gA до сих пор неясна. Показано, что он не является существенным для репликации в культуре клеток, однако может иметь важное значение для развития вируса в организме птицы. Выдвинута гипотеза о том, что gA является иммуносупрессором на ранних стадиях инфекции (102, 106). АГ В представляет собой связанный с поверхностной мембраной комплекс, состоящий из 3-х гликопротеинов - gpl00, gp60, gp48, причем последние 2 представляют собой части первого. Полагают, что В -АГ- комплекс играет центральную роль в нейтрализации вируса иммунной системой хозяина и может вызвать частичную защиту против БМ (143,148). Помимо АГ А, В и С, ВБМ содержит мембранный АГ (связанный с клеточной мембраной), общий для ВБМ и ВГИ. Его обнаруживают в ИФ на поверхности клетки. Полагают, что мембранный АГ связан с А АГ, так как оба они исчезают при аттенуации вируса (117). АГ В также общий для ВБМ и ВГИ и выявляется в РДП.

Метод ИФ, в котором использовали сыворотки от переболевших или гипериммунизиро- ванных птиц, оказался недостаточным, чтобы показать наличие АГ в опухолевых клетках (38). Однако аналогичная методика, в которой используют АТ, полученные от цыплят или кроликов, иммунизированных трансплантатом опухолевых клеток, позволяет выявить наличие специфического АГ на поверхности опухолевых клеток (67). Этот АГ получил название опухоле-ассоциированного поверхностного АГ (MATSA). Он обнаруживается в большинстве опухолевых клеток, трансплантируемых опухолях и трансформируемых клеточных линиях, но его нет в культуре фибробластов, инфицированной ВБМ либо ВГИ (131, 198, 157, 205, 142, 144). В опытах J.M. Sharm (183) большинство клеток-носителей MATSA осаждалось со скоростью, превышающей 3 мм/ч, тогда как клетки, осаждающиеся при более низкой скорости, не содержали этот АГ. Клетки-носители MATS А составляли 11,7% клеток опухоли. Инфекционны были и клетки-носители опухолевого АГ и клетки, лишенные его. Таким образом, клетки, содержащие вирусный геном, не обязательно являются носителями MATSA и не всегда трансформируются.

В 1972 г. Biggs (49) сообщили о выделении в птицехозяйстве непатогенного (неонкогенного) шт. ВБМ от здоровых цыплят и впервые предложили разделить имеющиеся изоляты на 3 родственные группы. К 1-й были отнесены вирусы, вызывающие острую БМ, ко 2-й - классическую, а к 3-й - апатогенные изоляты. Разделение вирусов на группы по патогенности совпало с серологической их классификацией, основанной на РИФ и РДП, с помощью которых Bulow и др. (58, 59) определили 3 серотипа. Серотип 1 включает все онко- генные вирусы и аттенуированные варианты, серотип 2 - все неонкогенные вирусы, серотип 3 - АГ родственные ВБМ вирусы герпеса индеек. Наличие 3-х серотипов в дальнейшем подтверждено PH вирусов, двумерным гель-электрофорезом и РИФ с применением монАТ (123). Серологическая классификация подтверждена сравнительными исследованиями фрагментов вирусных ДНК при обработке нуклеиновых кислот рестриктазами (44).

Вирусы серотипа 1 включают штаммы ВБМ, различающиеся по патогенности (онко- генности) для птиц. Высоковирулентные изоляты М.5, Ala-8, RB-IB выделены от цыплят вакцинированного поголовья во время вспышки БМ(7б). Эти вирусы вызывают значительный отход при БМ у генетически резистентной невакцинированной птицы или у генетически чувствительной вакцинированной ВГИ птицы. Witter (212) предложил называть очень вирулентными штаммы ВБМ (ОВВБМ), которые вызывают, характерные поражения в стадах птиц, длительное время вакцинированных препаратами на основе ВГИ. Вирулентные шт. серотипа 1 (GA, HPRS-16, JM) - вызывают значительный отход с коротким инкубационным периодом у генетически чувствительной, но не резистентной птицы (64). Умеренно патогенные классические шт. HPRS-17, Сопп-1 индуцируют опухоли только у незначительной части цыплят (39, 64). Они имеют тенденцию вызывать нервные явления. Наименьшую онкоген- ность среди шт. серотипа 1 имеют шт., подобные Си-1 ИЛИ CVI988 (67, 76), которые вызывают только нервные изменения. Вирусы серотипа 2 изолируются довольно часто. По- видимому они неонкогенны и не патогенны для цыплят (37, 76). Вирусы серотипа 3 включают апатогенные, неонкогенные вирусы герпеса, выделенные от индеек. Впервые ВГИ выделили в США Witter и др. (76) и Kawamura и др. (55) при исследовании индеек как возможного промежуточного хозяина и резервуара вируса БМ в природе. ВГИ широко распространен в коммерческих индюшиных стадах.

Серотипы ВБМ характеризуются сложной АГ структурой, изучение которой важно для дифференциации шт., выявления значения отдельных вирусспецифических (оболочечных антигенов) и вирусиндуцированных (гА) белков в иммунитете при БМ, проведения серологических исследований, интерпретации АГ родства ВГИ и ВБМ, а также для конструирования эффективных вакцин. Высокоспецифичным и чувствительным экспресс-методом, с помощью которого возможно изучение перечисленных вопросов, является ИФА. Решением Международного эпизоотического бюро ИФА признан официальным референс тестом. (15).

В Российской Федерации впервые разработаны методы ИФА индикации антигенов разных серотипов ВБМ и АТ к ним. В общем гликопротеидном АГ (гА), индуцированном ВГИ, содержатся 2 АГ детерминанты, одна из которых перекрестно реагирует со структурными компонентами вирулентных штаммов ВБМ, не имеет общих АГ связей с мелкофокусным вариантом ВГИ и аттенуированным ВБМ. Помимо теоретического, это открытие имеет и прикладное значение и побуждает пересмотреть существующее представление о роли отдельных АГ детерминант общего гликопротеидиого А АГ ВГИ и ВБМ (15).

АГ вариабельность и родство. Благодаря общему А-АГ различий в АГ характеристике штаммов данного вируса нет. Однако вирусы болезни Марека и герпеса индеек имеют АГ различия (200, 57). Такое различие было показано при использовании РИФ, преципитации с двойной диффузией в агаровом геле и PH (199). Так, в клетках, инфицированных ВГИ, АГ выявляется с помощью гомологичной сыворотки и в ядре, и в цитоплазме, тогда как в клетках, инфицированных ВБМ, он выявлялся антисывороткой к ВБМ только в ядре. Аналогичные результаты были получены С.В Лавровым, и др.(12). При заражении культуры клеток куриных фибробластов ВГИ (шт. М-24) через 24 и 48 ч после заражения наблюдалась флюоресценция ядра и цитоплазмы. Свечение ядер было диффузным, в цитоплазме были видны тонкогранулярные глыбчатые светящиеся участки. Однако попытки продемонстрировать перекрестную РДП ВГИ и ВБМ оказались неудачными (28,162). Поскольку ВБМ является клеточно-ассоциированным, постановка PH с ним затруднена.

Nazarian и др.(143) ЭМ охарактеризовали ультраструктуру вирионов ВГИ, которая оказалась чрезвычайно сходной с вирионом ВБМ.

Герпесвирусы голубей, сов, соколов, больших бакланов, человека (типов 1 и 2), вирусы болезни Ауески и инфекционного ларинготрахеита не имеют серологического и иммунологического родства с ВБМ. По А-АГ ВБМ и ВГИ родственны, но не идентичны.

Референтные шт. вируса Ж, HPRS-24, Fc-126 относятся к серотипам 1 и 2 и 3.

Патогенные свойства. Показано, что тяжесть острой цитолитической инфекции БМ зависит от штамма вируса, например, шт. Md-5 и Md-11 оказались сходными с прототипным штаммом БМ по оикогенности для чувствительных цыплят, иммунодепрессивной активности и антигенности. Другие же штаммы (JM/102 и JA-22) с большой частотой индуцировали острую цитолитическую инфекцию с атрофией бурсы и тимуса и ранней гибелью цыплят без развития лимфом, высокую онкогенность как для привитых ВГИ, так и непривитых.

В 1972 г. (50) описаны изоляты ВБМ различной патогенности. Они впервые разделены на 3 категории: 1 - вызывают остро протекающую БМ; 2 - вызывают классическое течение болезни; к 3-й относятся авирулентные изоляты. Высоковирулентные изоляты обычно встречались в 3 раза чаще в неблагополучных фермах, а авирулентные - у птиц из благополучных хозяйств. Так, изоляты Е-107/81 и Е-129/81 более вирулентны, чем вариант МД-S.

В Северной Италии выделено 2 высоковирулентных изолята вируса, обладающих им- мунодепрессивиым эффектом. Наиболее восприимчивы цыплята в первые 2 нед жизни. Петухи породы корниш более устойчивы к БМ и восприимчивее к лимфоидному лейкозу, а несушки породы белый плимутрок - наоборот. Относительная частота обнаружения вируса БМ в определенной популяции кур обратно пропорциональна его вирулентности. С увеличением возраста птиц наличие менее патогенных вирусов возрастает. Иногда из одного и того же стада выделяли вирусы 2-х типов. Следовательно, один и тот же цыпленок в полевых условиях может быть заражен вирусами более, чем одного типа. В 1972 г. Cho и Сепгу (70) решили проверить эту мысль, вызывая двойное заражение острым и слабым штаммами ВБМ цыплят, выращиваемых на подстилке из стружек, контаминированных штаммами, вызывающими острое заболевание. Этим, по существу, моделировано естественное двойное заражение в полевых условиях. В результате авторы установили интересный факт: птицы, зараженные одним штаммом (острым илн слабым), были защищены от заражения другим шт. У отдельных цыплят виремия не была постоянной по титру, у некоторых птиц состояния ви- ремии и невиремии чередовались. Различные типы цыплят реагировали на заражение по- разному (при одновременном заражении одной и той же окружающей среды); не ясно, являлось ли это результатом действия материнских АТ и фактом наличия у цыплят ВГИ. Виремия, вызванная шт. острой формы БМ (ID-1), наблюдалась у белых леггорнов уже на 1-й нед после заражения, а у птнц мясного типа - на 2-й нед. Реакция птиц разных генетических линий прн содержании их в одной и той же инфицированной среде оказалась различной.

Churchill и Biggs (74) работали с 2-мя шт. ВБМ (Ж и JA), которые поддерживались на 1-

дн цыплятах. Последних заражали кровью с интервалом 4-6 нед. В результате авторы показали, что шт. Ж вызывал высокую смертность цыплят с большими поражениями периферических нервов и половых желез, тогда как смертность цыплят от шт. JA была непостоянной, с более продолжительным латентным периодом. Присутствие шт. JA в организме зараженных цыплят характеризовалось следующими сроками: в почках вирус обнаруживали через 2 нед, в яичниках - к 7-й нед, в печени и селезенке - к 8-й нед и в головном мозге - к 4- й нед после заражения (92). Шт. JA оказался более внсцеротропным, так как прн заражении им антигены выделялись на 9 дн раньше в печени и на 4 дня раньше в 12-перстной кишке и легких, чем при заражении шт. Ж. Только при инфицировании шт. JA у птиц развивались опухоли в печени, сердце и селезенке, тогда как шт. Ж был более нейротропным и обладал большим тропизмом для гонад, чем шт. JA, что подтверждалось более ранним выявлением вирусного АГ и более тяжелыми поражениями периферических нервов и гонад (38).

Sohet К. and Calnek В. (177) описали новый изолят ВБМ: - вирус SB клон SB-1, который отличался от патогенных изолятов характеристиками роста in vitro, как описано для других апатогенных изолятов. Он не вызывал поражений, характерных для БМ, в течение 11-нед экспериментального периода и оказался неонкогенным. Однако при определенных условиях он может являться причиной воспалительного типа инфекции. Поэтому для классификации этого и похожих изолятов был предложен термин “неонкогенный” и “апатогенный”. Клон SB-1 защищал цыплят от вирулентного ВБМ и опухолевой трансплантации. Авторы при помощи гистологических исследований выявили различие между изолятами SB и HN-1, с одной стороны, и изолятом CU-2 с другой. Цыплята, зараженные CU-2, имели значительные поражения нервов, характеризующиеся обильной инфильтрацией большого количества лимфобластов, либо слабой лимфоцитарной инфильтрацией. В других органах, особенно в головном мозге и печени, наблюдались типичные для БМ поражения.

Purchase (167) привел ряд биологических маркеров, которые можно использовать для распознавания различий между вирулентными и аттенуированными шт. ВБМ и ВГИ. Такими маркерами являются: 1) патогенность; 2) морфология бляшек и цикл репродукции; 3) АГ различия; 4) круг хозяев (спектр патогенности); 5) патогенность для клеточных систем.

Онкогенные свойства. Проявляются не у всех штаммов ВБМ. По механизму онкоген- ного действия этот вирус значительно отличается от других онкогенных вирусов. Считают, что ВБМ трансформирует только Т-лимфоциты. В одной трансформированной клетке выявляют до 20 эквивалентов генома ВБМ (85). Онкогенные варианты вируса, по-видимому, кодируют характерные для них АГ детерминанты, отсутствующие у неонкогенных вариантов. Наиболее четкие различия наблюдаются в характеристике гликопротеида (gp5), позволяющие разграничить среди штаммов вируса варианты с высоко- и низкоонкогенными свойствами, а также отличить ВБМ от ВГИ.

Все опухолевые клетки содержат от 3 до 12 геномов ВГМ иа клетку, причем 90% вирусного генома транскрибируется с кодирующей нити 2-нитевой ДНК. Транскрибированная вирусспецифическая РНК в разных клетках кодируется одним и тем же фрагментом ДНК.

Локализация вируса. У птицы с признаками болезни вирус обнаруживают в крови. По организму он разносится лейкоцитами крови и размножается в клетках лимфоидных органов (фабрициевой сумке, селезенке, тимусе, миндалинах, слепой кишке), лимфоидных очагов инфильтрации, эпителиальных клетках почечных канальцев и особенно перьевых фолликул, где найдены зрелые вирионы, покрытые оболочкой. Вирус также содержится в лимфоретикулярных клетках гребия, сережек и голени. В первую нед его обнаруживают в тимусе, селезенке и бурсе, в результате чего развивается персистирующая инфекция клеток белой крови. Выделить вирус в свободном состоянии не удается. В перьевых фолликулах вирус находится у инфицированных птиц всех возрастов независимо от метода заражения. Он содержится в слущивающихся клетках.

Вирусоносительство и вирусовыделение. Патогенез и иммунитет при болезни Марека имеют исключительные особенности, накладывающие отпечаток на эпизоотологию и профилактику инфекции. Вирусоносительство, виремия и вирусовыделение после переболева- ния сохраняются практически всю жизнь, несмотря на устойчивость и присутствие ПА и ВНА. Даже вакцинация не предотвращает вирусоносительство и способность к контактному заражению. Более того, частота виремии на неблагополучных фермах выше у здоровых цыплят, чем у больных. Иными словами, переболевание или иммунизация практически не влияют на циркуляцию эпизоотического вируса. Высоковирулентные шт. вызывают гибель 1 -дневных цыплят. При заражении их слабо вирулентными штаммами они остаются носителями вируса в течение всей жизни, несмотря на устойчивость и присутствие ПА и ВНА.

Больная птица выделяет вирус через органы дыхания и пищеварения, а также с десква- мированным эпителием кожно-перьевых фолликул, эпителий которых служит местом размножения вируса. Установлена прямая связь между созреванием вируса в клетках фолликул и контагиозностью болезни. Вирусоносительство отмечено у клинически здоровой птицы не только во время инкубационного периода, клинического проявления болезии, но в течение 16-24 мес после переболевания, практически пожизненно, при наличии у такой птицы специфических (PH, РДП) АТ в 80-90% случаев.

Из эпителиальных клеток перьевых фолликул удалось получить очищенный вирус. Высушенные эпителиальные клетки перьевых фолликул сохраняют инфекционность для цыплят при аэрогенном заражении. Присутствие клеточио-свободного ВБМ в перьевых фолликулах зараженных 1-сут цыплят впервые обнаружено в 1970 г. (140). Вирус обнаруживался в фолликулах через 2 иед после заражения, концентрация его там нарастала с 3-й по 5-ю нед и снижалась к 6 и 7-й нед после заражения, 90-100% цыплят, зараженных вирулентным вирусом БМ в возрасте 0-2 иед, спустя 2 нед имели генерализованную инфекцию в перьевых фолликулах, вирусный АГ персистирует в них несколько месяцев (62).

У экспериментально зараженных суточных цыплят появление ИФ АГ в коже отмечалось с 56-го ди. В этот срок в коже наблюдали специфическую ИФ в 50%, в очинах пера - в 90% случаев, в то время, как преципитирующий АГ в этот срок и от тех же цыплят был установлен у 70,5% зараженных цыплят. Выделение вируса из кожи и очин пера в культуре клеток удавалось в 87,5% случаев. Клеточно-ассоциированный ВБМ выявляется в легких, лимфоидных органах через 1-4 дн после заражения, в лейкоцитах - позже. Затем он выявляется в нервах, головном мозге, печени, почках, гонадах. Титр вируса достигал пика в течение 2-х нед после заражения. Далее инфекционность снижалась, но улавливалась ещё 55 дн (51). Однако, в этих органах ие происходит созревания полного инфекционного вируса.

Что касается клеточно-свободного ВБМ в организме зараженных цыплят, то помимо эпителия перьевых фолликулов (63) он формируется в фабрициевой сумке в среднем в 52- 55% случаев. Выявить вирус в других органах (иервы, селезенка), а также в опухолях в этот период не удавалось. Эго свидетельствует о том, что в других тканях и органах изменения являются вторичными и находятся под влиянием иммунологических процессов (58).

Аналогичные данные получил Purchase (164). Он отметил, что вирусный АГ может длительно выявляться в перьевых фолликулах (несколько месяцев), в то время как в висцеральных органах или невральных вирусиндуцированных опухолях он в поздние сроки либо отсутствовал вовсе, либо обнаруживался в небольшом количестве клеток.

Не ясно, почему выделение вируса происходит лишь через перьевые фолликулы; между тем вирусный геиом присутствует и в других клетках больных кур, поскольку заболевание может быть искусственно передано свободными от вируса интактными клетками. Пока неизвестно, что мешает полной экспрессии вируса в этих клетках.

АГ активность. АГ ВБМ содержатся у больной птицы в эпителии перьевых фолликул. По содержанию их у экспериментально зараженных цыплят установлены значительные различия между онкогенным и неонкогенным ВБМ. В перьевых фолликулах, соответствующих онкогенному вирусу, содержалось достаточно АГ, реагировавшего в РДП через 3-6 иед после заражения. Материал из фолликул, инокулированных неонкогенным вирусом в РДП, за редким исключением реагировал отрицательно. Таким образом, исследование экстракта из перьевых фолликул в РДП может служить простым тестом для обнаружения оикогенной инфекции цыплят, а обнаружение ИФ и преципитирующих АГ в очииах перьев представляет собой надежный метод лабораторной диагностики.

У зараженной птицы образуются гуморальные АТ, способные нейтрализовать вирус in vitro. Чрез 1-3 нед после заражения или вакцинации в крови цыплят обнаруживают ВНА и ПА. в 85% случаев вирусный АГ выявляют в фолликулах кожи. У цыплят, зараженных вирулентным вирусом, АТ чаще обнаруживают в тех случаях, когда птицы остаются здоровыми, и значительно реже у больных птиц или в случаях персистирующей инфекции. Инфицированные несушки передают потомству через яйцо ПА, которые обычно сохраняются до 3- нед возраста и ие защищают против экспериментального заражения цыплят в 1-дн возрасте.

Экспериментальная инфекция. Ранее предпринимали много попыток экспериментальной передачи БМ. Однако впервые болезнь была успешно и неоднократно передана лишь в начале 60-х гг. (218). Оказалось, что кровь или опухолевый материал, содержащий живые интактные клетки, могут передавать заболевание чувствительным 1-дн цыплятам. Любые обработки инокулята, которые убивают клетки или разрушают их целостность, разрушают и инфекционность вируса.

Цыплят удавалось заражать внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно, интрацеребрально, интранефрально. Чувствительность к экспериментальному заражению выше у цыплят суточного возраста, чем у 2-3 и 10 нед. Суточные экспериментально зараженные цыплята после инокуляции вируса выделяют его со 2-й до 3-й нед. Микроскопические поражения развиваются уже на 2-й нед, а макропоражения и симптомы болезни проявляются не раньше, чем на 4-й нед или даже позднее. При заражении 1-сут цыплят в нос апатогенным xirr. ML-6 вирусные внутриклеточные АГ были обнаружены на 3-й дн в легких, на 5-14 дн - в лимфоидных органах и на 14-30 дн - в фолликулах перьев. Вирус изолирован из селезенки на 14-30-й дн. После 10-го дн в сыворотке методом ИФ выявлялись АТ (125).

Смертность экспериментально зараженной птицы от 0,2 до 79,9% при наблюдении в течение 65-210 дн. Все цыплята, зараженные в 1-сут возрасте, как правило, погибают, в то время как гибель 2, 3 и 10-нед цыплят составляет соответственно 60, 30 и 10%. Возрастная устойчивость обусловлена различной способностью организма цыплят продуцировать специфические АТ. Наличие у цыплят материнских пассивных АТ к ВБМ защищает их от заражения. Введение 1-сут цыплятам лимфоцитов от больных цыплят после предварительного их культивирования in vitro ведет к развитию болезни. Полагают, что возможна интеграция ВБМ с геном клеток кур (лимфоцитоз).

При остром течении экспериментальной инфекции клиническое проявление болезни отмечено через 20-85 дн, первоначальные патоморфологические признаки - через 21-60, гистологические изменения - через 12-21 дн. Специфические АТ в сыворотке крови и вирусспецифический АГ в эпителии перьевых фолликулов выявлены соответственно через 21-28 и 28-60 дн. При экспериментальном заражении вакцинированных 3-нед цыплят вирусный АГ в перьевых фолликулах появляется через 1-5 нед и при смертельном исходе выявляется до момента гибели, а у выздоровевших птиц постепенно исчезает.

При экспериментальном заражении 1-дн SPF-цыплят непатогенным вирусом ML-6 БМ серотипа 2 внутриклеточные вирусные АГ (VJAS) обнаруживали в селезенке и фабрициевой сумке 5-14 дн, в легких - через 3 дн и в перьевых фолликулах - спустя 14-30 дн после заражения, но не обнаруживали в этих органах (кроме перьевых фолликулов) через 21 дн после заражения. Показано, что в период через 5-14 дн после инфицирования наиболее часто были инфицированы ВБМ делящиеся В-клетки фабрициевой сумки и селезенки. Таким образом, при инокуляции цыплятам вируса ML-6 его репликация происходила в лимфатических органах первоначально в b-клетках бурсы и селезенки (125).

Чувствительность к экспериментальному заражению у птиц разных пород и линий неодинакова; чаще болеют куры мясных пород и особенно белые плиму троки. В 1969 г. Сик- корди высказал мысль, что БМ - инфекция лимфоцитов, поэтому заразить птиц до начала функционирования у них лимфоцитов не удается. Инфекция лимфоидных клеток приводит к трансформации и образованию специфического опухолевого АГ, пролиферации и образованию опухолей. После инъекции небольшого количества неповрежденных опухолевых клеток ВБМ здоровым, но восприимчивым к заболеванию цыплятам не удается снова выделить из этих клеток вирус. И только в редких случаях удавалось получить вирусные частицы из опухолевых тканей зараженных птиц (41,138).

Экспериментальная инфекция суточных цыплят изучена при различных методах заражения: интраперитонеальном, интраназальном, внутриглазном, в переднюю камеру глаза. В качестве иноку лята использовали цельную кровь, суспензию клеток яичников, нервов и эпителия фолликулов. Авторы показали, что частота заболеваемости зависела от вида инокуля- та и метода заражения. Экспериментально вызванное заболевание было сходно с классической формой (175). Первое микроскопическое изменение - адвентициальная клеточная пролиферация головного мозга. Она наблюдалась во всех случаях с 1 по 8 нед после заражения. Следовательно, ткань головного мозга первой отвечает на заражение ВБМ. Вирус, введенный в глаз экспериментальным цыплятам, вызывал 3 формы БМ. Наблюдались изменения в глазу, конъюнктиве, хрусталике, целлюлярном теле и сетчатке, которые ранее не были описаны. Рецидивов иридоциклитов не отмечали. Выделенный вирус по его патогенным характеристикам относится к группе велогенных агентов (132).

Экспериментальная инфекция шт. HPRS-B14 характеризуется поражениями периферических нервов. У некоторых цыплят развивались лимфоидные опухоли, главным образом, в яичниках. Экспериментально вызванная БМ практически почти не отличается от естественной, разница лишь в длительности латентного периода. Куры оказались более чувствительными к шт. HPRS-B14, чем петухи.

Цыплята без материнских АТ, зараженные экспериментально, гибли через 10-17 ди после периода депрессии и остановки роста. Вирус всегда присутствовал в крови цыплят с клиническими симптомами болезни. Титр вируса в крови составлял 10-3,6 - 10-4,2 ИД 50/мл. Плазма цитратной крови после центрифугирования её при 2000 мин'1 была также инфекци- онна, но содержала меньше вируса, чем цельная кровь (51). Около 95% инфекционности цельной крови связано с её клеточной фракцией. Быстрое замораживание до -70°С сильно снижало инфекционность опухолевой суспензии и цельной крови.

БМ была воспроизведена экспериментально на 10-11-дн КЭ и 1-7-дн цыплятах при инокуляции им крови и взвеси опухолевых клеток, смывов со скорлупы яйца и суспензии из перьевых фолликулов. Инфекционность суспензии из перьевых фолликулов была самой высокой и вызывала заболевание 52% зараженных цыплят и 57,5% КЭ. Патогенность изолятов ВБМ установлена для цыплят 1-7-дн возраста и 10-11-дн КЭ независимо от способа введения инокулята. Возбудитель, выделенный из крови, перьевых фолликулов от домашних кур и диких птиц, оказался идентичным (3).

При внутривенном заражении эмбрионов в 10- или 17-дн возрасте цыплята вылуплялись нормально, но заболевали БМ после инкубационного периода такой же продолжительности, как цыплят, зараженных в 1-дн возрасте. Заражение 10-дн КЭ в аллантоисную полость вызывает БМ у вылупившихся цыплят. При заражении КЭ в желточный мешок вирусом, вызывающим классическую форму БМ, отмечали перикардиты, спленомегалию и наличие бляшек в селезенке (38).

У экспериментально зараженных цыплят первые клинические проявления болезни отмечались через 5 нед после заражения. Течение болезни имело 3 периода: с 5 по 15 нед отмечалась вялость, атаксия, потеря координации движения, диарея, бледность сережек и гребня, далее с 15 по 30 нед - постепенное ослабление нервных симптомов, исчезновение диареи, появление позы пингвина и, наконец, с 30 по 56 нед часть птиц находилась в позе пингвина. С 34-й нед клинические проявления болезни исчезали, но птица была очень ослаблена по сравнению с контрольной. Цыплята, выжившие после экспериментального заражения ВБМ в 2-3-нед возрасте, являлись носителями вируса до 16-24-мес возраста. Вирус у таких птиц содержался в крови до 24-мес возраста (90).

Контактный способ заражения птицы в экспериментальных условиях оказался таким же эффективным, как и внутрибрюшинный - введение вируссодержащей крови больных птиц- доноров. Контактно зараженные ВБМ цыплята погибали от БМ через 4 мес.

Индюки оказались менее чувствительны к культуральному ВГИ, чем куры, но более чувствительны к заражению лейкоцитарной кровью, содержащей ВГИ (202).

Инфекция у индюшат, вызванная ВБМ. Вопрос о чувствительности индюшат к ВБМ имеет противоречивое толкование. По одним данным у 3-х из 7 зараженных индюшат развились лимфоидные опухоли, причем 2 из них пали на 43-й и 50-й дн после заражения. Ни один из зараженных индюшат не имел ПА и реизолировать от них ВБМ не удалось. В итоге сделали вывод о нечувствительности индюков к экспериментальной инфекции БМ.

Однако в 1977 г. (151) показана высокая чувствительность индюшат к шт. Джорджия ВБМ. Заражали ВБМ 1-сут цыплят и индюшат путем введения инфекционной плазмы или гомогената опухоли и выращивали их в изоляции в течение 29 нед. Инокуляты оказались патогенными для цыплят и индюшат и вызывали высокую смертность (100% у цыплят и 70% у индюшат). Изменения наблюдали в печени, селезенке, легких и других висцеральных органах. Микроскопически пораженные ткани инфильтрированы плеоморфной популяцией неопластических лимфоцитов. Авторы не выявили изменений воспалительного характера. От экспериментально инфицированных цыплят и индюшат был реизолирован ВБМ и у этих птиц обнаружены ПА. Данная работа показала, что индюшата высоко чувствительны к экспериментальному заражению шт. ВМБ. Эти данные (151) были подтверждены (5).

Однако в индюшиных стадах БМ не проблема. Возможное объяснение этого - присутствие у индеек ВГИ, который будучи АГ родственным ВБМ защищает индюшат от болезни.

Культивирование. ВБМ удается культивировать в организме 1-дневных цыплят и в КЭ (10-12- и 4-дн возраста при заражении на ХАО и в желточный мешок, соответственно в культуре фибробластов и почечных клеток куриных и утиных эмбрионов, в культуре клеток почки 2-8 нед цыплят малочувствительной к БМ линии. Заражение КЭ в желточный мешок ведет к образованию характерных бляшек на ХАО (Рис. 98), поэтому некоторые исследователи считают использование эмбрионов эффективным методом выделения БМ (196).

Шт. В-14 ВБМ поддерживали внутрибрюшинной инокуляцией 1-2 дн цыплят разных линий с интервалом 3-10 нед кровью, взятой от птиц с клиническими симптомами БМ. В течение 70-100дн наблюдения за цыплятами на протяжении 40 последовательных пассажей заболевание у них колебалось в пределах 29-87% у RIR,12-40 у EBrL и 27-58% у HPRS-BrL

В культуре клеток почек цыплят и фибробластов утиных эмбрионов ВБМ образует характерные бляшки (138, 189). Хотя в первых пассажах этот вирус не вызывает образования бляшек в культуре клеток куриных фибробластов, но при дальнейшем пассировании в чувствительных культурах он приобретал эту способность которая возрастала с увеличением количества пассажей (165). ЦПЭ характеризовался образованием округлых рефрактильных клеток и поликариоцитов. Размер и число последних варьировалось в зависимости от типа культуры клеток и пассажа вируса. Зараженные клетки погибали, продуцируя большое количество вирусного АГ и голых вариантов, которые можно наблюдать в тельцах-включе- ниях и ядрах большинства зараженных клеток.

Штаммы различаются по активности репродукции в культуре клеток, характеру ЦПД, морфологии бляшек и количеству клеточно-свободного инфекционного вируса. По морфологии бляшек можно дифференцировать вирулентные штаммы от слабо вирулентных. Так, шт. CPRL-11 ВБМ утрачивал патогенность (онкогенность) для цыплят после его серийного пассирования in vitro в клетках куриных эмбрионов. При длительных пассажах вируса в культуре клеток А-АГ исчезал, поэтому при изучении АГ структуры вируса он не должен пассироваться более 10 раз. По бляшкообразованию в культуре клеток штаммы ВБМ делят на 3 группы : высокоонкогенные, вызывающие в клеточных культурах образование бляшек средних размеров, и неонкогенные изоляты, вызывающие образование мелких бляшек; ВГИ и аттенуированный ВБМ, вызывающий образование крупных бляшек. Высказана мысль о возможной связи между бляшкообразованием и патогенностью полевых штаммов ВБМ (21). ВБМ удавалось размножать в органных культурах почек, селезенки, гонад и легких цыплят 3-

4-нед возраста. Вирус не репродуцировался в культуре клеток млекопитающих, и все попытки в этом отношении оказались безуспешными.

Титрование ВБМ в культуре клеток основано на его свойстве образовывать бляшки без агарового покрытия, так как возбудитель является клеточносвязанным. Его также удавалось серийно пассировать и на 1-сут цыплятах, свободных от материнских АТ, заражая их ин- траперитонеально в дозе по 500 БОЕ на цыпленка. С увеличением числа пассажей виру- 45 Зак. № 171 705 лентность вируса снижалась. Неспособность ВБМ в клеточной культуре выделяться во внеклеточную среду связана с его внутрицитоплазматической деструкцией. Данный вирус может быть в 2-х формах: тесно вязанным с клеткой н свободным от интеграции с какими-то клеточными структурами. В организме инфицированной птицы вирус размножается и созревает только в эпителиальных клетках перьевых фолликул, где инфекционные внрионы связаны с большим количеством цитоплазменных клеточных включений. Эти включения, вероятно, связаны с синтезом бесклеточного инфекционного вируса. В то же время было замечено, что вирус можно выделять из зараженных культур клеток, используя специальные методики их обработки (ультразвук, хелаты, бикарбонат-диамин - тетраацетат).

Аттенуированные шт. ВБМ, а также прнродноослабленные вакцинные шт. ВГИ не созревают в эпителии перьевых фолнкулов цыплят, и поэтому вакцинированная вирусом этих штаммов птица не передает возбудителя посредством контакта.

Предложен простой способ дифференцирования in vitro ГВИ и ВБМ с использованием клеток линии Т35 (нз опухоли японской перепелки). ГВИ образует в этой культуре мелкие бляшки, отсутствующие при заражении ВБМ. В настоящее время клетки Т35 успешно применяют для избирательного выделения и накопления ГВИ. Установлено, что гены US1, US10 (US2) не нужны для роста ВБМ в ФЭК. Делегированные гены не нужны для заражения цыплят (149). Проведен анализ распределения позитивных по АГ 1а -дентритных клеток, В-клеток и позитивных по ВБМ АГ клеток в лимфоидных органах и ХАО 13 дн КЭ, инфицированных ВБМ серотипа 1, ВБМ изолята В и 3-мя вакцинными штаммами (CVI 988, SB1, HVT - 1 - 2 н 3-го серотипов соответственно) (85а).