ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ

Морфология и химический состав. Вирус чумы КРС (Рис. 39) и мелких жвачных в своей структуре имеет 6 белков (Н, F, L, N, Р и М), которые характеризуются высокой степенью гомологии.

Сконструирован рекомбинантный вирус ядерного полиэдроза Autographa californica, экспрессирующий N белок нуклеокапсида в клетках насекомых S19 и в личинках Spudaptera frugipezda. Рекомбинантный N белок использован в качестве покрывающего АГ в ИФА для того, чтобы отличить вакцинированных животных от животных инфицированных ВЧ КРС, а также для диагностики 2-х других морбилливирусов ВК и ВЧ. Неочищенного лизата одной инфицированной личинки достаточно для серологической диагностики 7200 образцов сыворотки (31). Н-ген у штамма К ВЧ КРС, кодирующий белок гемагглютинина, определяет вместе с белком А основные иммуннобиологические свойства этого вируса (2).

В последнее время проведены работы по созданию банка клонов ДНК и определению первичной структуры концов некоторых кДНК для дальнейшей работы по определению полной структуры генома, изучению структурной организации штаммов ВЧ КРС и конструирования генноинженерных вакцин (экспрессия фрагментов структурных генов в E.coli). Фрагменты кДНК на Н или F гены могут быть использованы для диагностики ВЧ КРС методом гибридизации (1а, 2,2г). Устойчивость. В отношении физических факторов ВЧ КРС нестоек и легко разрушается под влиянием химических веществ. Нагревание до 60°С убивает его немедленно, до 55°С -

за 20 мин; в условиях комнатной температуры вируссодержащая цитратная кровь сохраняет активность 4-6 дн, при 5°С - 1 нед, при 0°С - более 5 лет.

Таблица У1.3.Нуклеотидная последовательность между Н-генами штаммов ВЧ КРС и аминокислотная гомология соответствующих Г А. Участок Н-гена Уюовень гомологии между папами штаммов К - Ь КаЬе1 О - Ь КаЬеКЭ - Я 1-1951 87,63 87,44 87,84 1-485 93,05 89,75 89,57 486-1311 86,42 87,17 88,61 1312-1850 88,50 89,45 90,17 1851-1952 67,96 65,69 80,39 Г емагглютинин 1-609 86,34 88,01 90,15 1-155 97,42 92,90 91,63 156-430 82,55 85,09 88,73 431-609 89,94 88,27 91,06

Время инактивации терморезистенгного вируса, за которое инактивируется 50% его при 45°С, составило 4 дн вместо 1,8 дн для исходного родительского вируса. Полученный терморезистентный клон (1613-1009) характеризовался безвредностью для КРС и высокой им- муногенностью, что позволило использовать его для производства сухой лиофилизнрован- ной, устойчивой к хранению вакцины.

В мясе больных животных вирус сохраняется в зависимости от скорости аутолиза и количества молочной кислоты. Если pH изменяется в кислую сторону - вирус погибает за 4-6

ч.

Антигенная структура. Антигенная структура изучена недостаточно. Идентифицировано 5 вирусспецифических полипептидов: Н (в РГА) размером 74 кД; белок нуклеокапсида размером 62 кД; (фосфопротеид) размером 70 кД; белок слияния Бо размером 46 кД и полипептид М (матриксный белок) размером 38 кД. Изучена гомология в нуклеотидной последовательности белка слияния у 3-х вирусов (чумы КРС, чумы собак и кори). Проведено клонирование и анализ последовательности гена фосфопротеина ВЧ КРС (25). Получены монАТ к структурным белкам (нуклеотидному белку и гликопротеинам Н и Б о) вакцинного шт. К17.79 ВЧ КРС (5). Показано, что из 24 видов монАТ 10 распознавали нуклеопротеин (№), 8- фосфопротеин, 4 - ГА (Н) и 2 - белок слияния (Бо). МонАТ против Н нейтрализовали инфекционную активность вируса, тогда как подобные АТ против Бо белка проявляли нейтрализующую активность только в присутствии комплемента морской свинки (41). Также с помощью монАТ к нуклеокапсидному белку Np, ГА (Н) и белку Fo изучена персистен- ция вируса и синтез белка М в клетках Vero (40).

Антигенная вариабельность и родство. АГ вариантов вируса нет. Иммунологическая идентичность полевых штаммов подтверждена многочисленными опытами перекрестного заражения.

Локализация вируса. Вирус разносится кровью по всему организму и исчезает из нее с поражением ЖКТ (обычно с 4-го по 10-й день). Вирусемия совпадает с периодом гипертермии. Иногда вирус обнаруживают в крови на протяжении всей болезни и даже за 12 ч до начала лихорадки. Его можно обнаружить в выделениях из носовой полости с 6-го по 14-й день, в органах животных, убитых на 6-й день. За день до развития лихорадки и через несколько часов после смерти животного большое количество вируса содержится в слезном секрете. Концентрация вируса в крови не превышает 102-104 ТЦД50/МЛ.

ВЧ КРС - пантропный вирус. В органах и тканях накапливается неодинаково, в более высоких титрах находится в лимфоузлах (106,5 ИД50/МЛ), в слизистой оболочке сычуга (105,5), в легких (Ю4) и почках (103-104 ИД50/МЛ). В небольших количествах он присутствует в мозговой ткани, поперечнополосатой мышечной ткани и спинномозговой жидкости. Вирусоносительство у животных-реконвалесцентов практически не доказано.

Антигенная активность. У животных-реконвалесцентов обнаруживаются ВНА, КСА, анти-Г А и ПА. Поэтому наиболее надежными методами оценки поствакцинального иммунитета являются PH и РСК. Телята приобретают иммунитет через молозиво от коров- реконвалесцентов или активно иммунизированных. Он сохраняется 6-8 мес. Поскольку материнские колостральные АТ тормозят образование иммунитета, телят нельзя вакцинировать ранее этого срока. У ягнят пассивный иммунитет сохраняется не менее 4-х мес (38). Изучались различные участки гемагглютинина и их роль в проявлении иммунобиологических свойств его и вируса в целом (2а).

Экспериментальная инфекция.

Культивирование. Вирус культивируется в организме восприимчивых животных и в культурах клеток почки телят без предварительной адаптации. Вирус чумы КРС хорошо размножается в первичных культурах клеток почки теленка, ягненка, эмбриона коровы, макрофагах и перевиваемых клетках. ЦПД вируса развивается медленно и длится при использовании больших концентраций вируса в течение 5-8 сут. Вслед за появлением цитоплазматических включений в инфицированных клетках, в том числе и сим пластах, образуются внутриядерные оксифильные включения в количестве 2-4. Хроматиновая сеть ядра нарушается лишь вокруг включений. В некоторых случаях они занимают почти все ядро.

Развитие вируса в культуре начинается через 3-6 ч после заражения. В этот период вирус ни в клетках, ни в среде не обнаруживается. Культура клеток СПЭВ чувствительна к ви- русу чумы мелких жвачных животных и может быть использована для изготовления диагностических АГ (6а).

Специфичность цитопатических изменений подтверждаются PH. Цитопатические изменения развиваются одновременно с накоплением вируса в инфицированных культурах клеток. Новую популяцию вируса обнаруживают через 6-8 ч после заражения в титре 103-104 ТЦД 50/мл. Позднее титр вируса нарастает и к 5-7 сут достигает максимальной величины (105’5-106’5 ТЦД50/МЛ).

е сут равен 1:16 - 1:64 (24, 27, 34). В клеточной линии почек африканских зеленых мартышек вирус образует бляшки. Однако лапинизированный (ЫП) и капринизированный штаммы вируса, размножаясь в культуре клеток, не вызывают в первых пассажах ЦПД.

Помимо первичных культур клеток, культивирование вируса удавалось и на перевиваемых линиях клеток. Отработаны основные параметры поддержания клеток и ВЧ КРС шт.ЛТ, определен возраст культуры, плотность клеток в монослое, состав питательной среды, периодичность её смены, доза заражения клеточных культур МДВК, ПТП, ПС, СПЭВ, время сбора вируса (5а). Линия клеток СПЭВ оказалась более чувствительной к вирусу чумы мелких жвачных. ЦПД выявлялось с 1-го пассажа, процент пораженных клеток составлял 70-90. ЦПД проявлялось на 3-11 сут в зависимости от количества проведенных пассажей. Титр вируса на культуре Уего составлял 104 ТЦД50/МЛ. Культура СПЭВ, как наиболее чувствительная к ВЧ МЖЖ, может быть использована для изготовления диагностических АГ (6а). Вирус способен индуцировать образование интерферона в культуре клеток, причем более старые культуры образовывали больше интерферона, чем молодые.

ГА свойства. Г А ВЧ КРС получают экстрагированием вируссодержащей культуры клеток эмбриона КРС. Экстракт концентрируют в 20 раз диализом. Концентрированный вирус с титром не ниже 106 ТЦД зо/мл агглютинирует эритроциты обезьян и в меньшей степени эритроциты кроликов, морских свинок, мышей и крыс. Г А ВЧ КРС и ВК антигенно различны, а иммунологическое родство обусловлено присутствием общего АГ в их нуклеокапсидах (13). Клонирован ген Г А шт. КаЬе1е О и лапинизированного штамма. Показано, что в гене ГА шт. КаЬе1е О по сравнению с геном лапинизированного штамма отсутствуют первые 17 нуклеотидов (48). Гемагглютинирующий АГ у ВЧ КРС выявляют только после специальной обработки. Антисыворотка к ВЧ КРС нейтрализует Г А активность вируса кори (3).

ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

Последние случаи возникновения чумы КРС, вследствие заноса из Монголии (1991 ), были зарегистриованы в Читинской области и Республике Тува (1991-1993 гг.). В последние годы неблагополучными по чуме КРС ежегодно являются 8-13 африканских и азиатских стран, в том числе Иран и Турция, из которых возможен занос возбудителя на территорию России (6). Получены данные о циркуляции ВЧ КРС среди мелких жвачных, содержащихся совместно с поголовьем яков и КРС, перенесших эпизоотию и привитых вирус-вакциной. Установлено участие овец и коз в эпизоотии чумы яков (10).

Идентифицировано две линии штаммов. Одна включает изоляты из Восточной и Западной Африки, полученные в 1960 г., филогенетически родственные азиатским и ближневосточным изолятам. Вторая линия включает большинство изолятов, полученных в Восточной, Западной и Северной Африке в 1983-1993 гг. Во время эпизоотиии в Нигерии в 1980 г. совместно циркулировали изоляты обеих линий (46).

Источники и пути передачи инфекции. Источник инфекции - больные и переболевшие чумой животные. Распространению ее способствуют трупы павших и вынужденно убитых животных, шкуры, кишечное сырье, кости, рога, копыта, шерсть. Определенную роль в распространении болезни могут играть козы и овцы, которые чаще переболевают бессимптомно. Собаки, хищники, птицы могут разносить вирус механически в случае поедания трупов животных, павших от чумы. Имеются сообщения о распространении чумы сусликами. Механический перенос вируса возможен через одежду обслуживающего персонала, корм, воду, подстилку, предметы ухода, транспорт. У клещей, слепней и мух вирус обнаруживали через 15-30 мин после того, как они находились на больном чумой животном. В естественных условиях заражение чумой происходит через пищеварительный тракт, возможно также через слизистую оболочку носовой полости и конъюнктиву.

Спектр патогенности в естественных условиях. К вирусу восприимчив КРС, зебу, буйволы, иногда поражаются овцы и козы. Яки и верблюды переболевают легко. Дикие жвачные (лани, антилопы, газели, жирафы) болеют и могут распространять болезнь на огромные пространства. Буйволы менее восприимчивы, чем КРС, однако иногда болезнь среди них принимает злокачественный характер. В Индии наблюдается заболевание свиней, вызванное этим вирусом. В природе встречаются штаммы, высокопатогенные для КРС, но не вызывающие заболевания овец и коз, и штаммы, патогенные для всех этих животных. Однако в последние годы установлено, что ВЧ КРС и ВЧ мелких жвачных животных ВЧ МЖЖ значительно различаются между собой. ВЧ МЖЖ не является вариантом ВЧ КРС. Это оригинальный вирус, который на шкале родства в пределах Морбилливирусов одинаково далек от ВК и ВЧ КРС (34). Чувствительность к ВЧ КРС различна и зависит от породы (местный скот менее чувствителен, чем скот улучшенных пород), эпизоотического состояния страны (там, где чума встречается энзоотически, скот менее восприимчив и легче переболе- вает благодаря остаточному иммунитету) и физико-географических условий (наблюдалась меньшая восприимчивость скота в низменных местах, чем в горных).

ДИАГНОСТИКА

Диагноз ставят на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных, результатов лабораторных исследований и биопробы на восприимчивых животных. Лабораторная диагностика предусматривает: выделение вируса в культуре клеток и идентификация его в PH, обнаружение вирусного АГ в органах и тканях от павших и вынужденно убитых животных в РСК, РДП, ВИЭОФ, РТНГА, РНГА, РИФ, ИФА; обнаружение специфических АТ у переболевших животных в РСК, PH, РДП, РТГА, ИФА. Разработан экс- пресс- метод диагностики болезни и видовой дифференциации морбилливирусов. Для этого используется ПЦР небольшого участка (430 п.н.) P-гена с 389 по 821 н. в связи с тем, что нуклеотидная последовательность его 5'- и 3'- концов является достаточно консервативной, что позволяет унифицировать праймеры для всех морбилливирусов. С другой стороны, участок, ограниченный этими праймерами, имеет достаточную степень вариабельности, что позволяет дифференцировать видовую принадлежность вируса. Нуклеотидная гомология ам- хшифицированного участка P-гена в парах ВЧ КРС - ВЧ МЖЖ, ВЧ КРС - ВЧС, ВЧ МЖЖ - ВЧС для исследованных штаммов составляет соответственно 66,67, 60,84 и 59,21%. Нуклеотидная гомология этого участка гена Р у вируса, выделенного от норок ,с ВЧ КРС, ВЧП и ВЧ МЖЖ составила 60,84, 98,6 и 59,21% соответственно (26).

Выделение вируса

Взятие и подготовка материала. Материал для выделения вируса берут от больных (кровь, пунктат лимфоузлов) или убитых и павших животных (предлопаточные, мезентериальные лимфоузлы, селезенка). Патматериал берут в стерильную, плотно закрывающуюся посуду и доставляют в лабораторию нарочным в опечатанном термосе со льдом при строгом соблюдении мер предосторожности. Гепаринизированную кровь в стерильных условиях разливают по пробиркам и центрифугируют при 2500 мин-1 15-20 мин. Образовавшийся слой лейкоцитов между эритроцитами и плазмой в форме суспензии или пленки переносят пастеровской пипеткой в стерильный флакон. Пленку лейкоцитов отмывают от эритроцитов питательной средой и измельчают. Суспензию лейкоцитов в питательной среде используют для заражения культуры клеток. Заражать последнюю можно и цельной кровью (29, 44, 45). Вирус от больных животных можно выделить прижизненно из пунктата предлопаточных лимфоузлов в инкубационный период за сутки до начала лихорадки, а затем на всем протяжении болезни.

Лимфоузлы и селезенку можно хранить при -20°С в течение 60 дн, при -40°С - 6 мес, при 2-4°С - ие более 7 дн. В кусочках размером 1-2 см, помещенных в 10%-ный №С1, вирус сохраняется при 2°С 15-30 дн. Вируссодержащая цитратная кровь в условиях комнатной температуры сохраняет активность 4-6 дн, при 5°С - 1 нед, при 0°С - 3-4 нед. В лиофильно высушенном материале, находящемся в ампулах под вакуумом при -20°С, вирус выживает более 5 лет, а при 2-4° С - не менее 1 года. При лиофилизации в качестве стабилизатора в суспензию добавляют 2% глюкозы и 5% пептона.

Заражение культуры клеток. Используют культуру клеток почки телят, которую после удаления ростовой среды заражают, нанося на слой клеток суспензию лейкоцитов исследуемого животного или суспензию его органов. Для адсорбции вируса культуры выдерживают 2 ч при 37° С, после чего инокулят отсасывают и вносят питательную среду с 2,5% телячьей инактивированной сыворотки. За культурой наблюдают 9-18 дн. На положительный результат указывает ЦПЭ. При отсутствии ЦПЭ делают слепой пассаж. Обычно при изоляции вируса таким методом затрачивается 20-25 дн. Идентификацию проводят в PH.

Заражение восприимчивых животных. Рекомендуют заражать молодняк КРС или телят буйволов кровью или 10-20%-ной суспензией лимфоузлов, полученной от больных животных в первые 5 дн после заболевания. Животным вводят подкожно 10 мл исследуемого материала. Это неразбавленная кровь или 10-20%-ная суспензия селезенки и лимфоузлов. На положительный результат указывает подъем температуры тела через 5 дн после заражения и последующее развитие типичной картины болезни. Смертность очень высокая - около 90%. В случае выздоровления животных дополнительным критерием специфичности течения болезни является рост уровня АТ.

Индикация и идентификация вируса

Вирусоскопия. ЭМ и ИЭМ в практических условиях не применяются. Из экспресс- методов диагностики наибольшего внимания заслуживает применение гибридизационного зонда. С помощью его (точечной гибридизации) удается дифференцировать два родственных морбилливируса - ВЧ КРС и ВЧ МЖЖ (28). Дифференциальная диагностика с помощью ДНК-зондов помогла идентифицировать вспышку чумы КРС среди популяции баранов в Индии (39).

Обнаружение специфических телец-включений. В зараженных культурах клеток в цитоплазме одиночных клеток и сим пластов появляются сначала мелкие эозинофильные включения округлой формы со светлым ободком вокруг. С увеличением размеров симпла- стов растут объем и число цитоплазматических включений. Последние принимают многоугольную, продолговатую формы или форму кольца, охватывающего ядра симпластов; в цитоплазме располагается до 10 включений. Вслед за появлением цитоплазматических включений в инфицированных клетках, в том числе и в симпластах, образуются внутриядерные оксифильные включения в количестве 2-4. Хроматиновая сеть ядра нарушается лишь вокруг включений. В некоторых случаях они занимают почти все ядро.

Биопроба. Идентифицировать ВЧ можно биопробой на иммунном и неиммунном скоте. Двух животных вакцинируют сухой вирусвакциной из шт. ЛТ (согласно утвержденному наставлению по применению препарата). Через 12 дн вакцинированных и двух невакциниро- ванных животных заражают испытуемым материалом (суспензия селезенки, лимфоузлов и крови). При наличии у невакцинированных животных специфической температурной реакции, клинических признаков и отсутствии таковых у иммунных животных биопроба считается положительной. У заболевших или павших животных обнаруживают специфический АГ в РСК и РДП. PH. Применяют качественную и количественную PH. Для установления специфичности вызываемых вирусом поражений клеток проводят качественную PH, а для определения количества АТ в сыворотке иммунных животных - количественную.

РСК. Применяют для прижизненной и посмертной диагностики чумы с целью выявления АГ в гомогенатах лимфоузлов, селезенки, а также в инфицированной культуре клеток. При использовании РСК с целью идентификации вируса в культуре клеток в качестве специфического и контрольного АГ используют культуральную жидкость с зараженной и неза- раженной культурами клеток.

Предложена упрощенная модификация РСК для определения растворимых АГ ВЧ КРС. АГ готовят из лимфоузлов или селезенки КРС, коз и кроликов. Отмечено, что АГ, подвергнутые замораживанию - оттаиванию или ультразвуковой обработке, или осаждению сульфатом аммония или сульфатом натрия, более активны.

Гипериммунные сыворотки для идентификации вируса готовят по методу Скотта. Кровь берут от кроликов, иммунизированных лапинизированным, авинизированным или ЛТ- вирусами. Такие сыворотки нужны для обнаружения испытуемого АГ в РСК. Положительные сыворотки и соответствующие им контроли (нормальные сыворотки) получают на КРС в возрасте 12-18 мес. От них берут сыворотку до иммунизации (контрольная) и через 21 день после подкожной прививки 100 иммунизирующих доз (позитивная сыворотка). Такая сыворотка обычно в PH реагирует положительно в разведении 1:40 - 1:80. Полученную сыворотку сохраняют при -20°С и используют в РСК и PH с испытуемым АГ в течение 4-6 мес. Диагностическую сыворотку для РСК получают также от кроликов, инфицированных, а затем гипериммунизированных ВЧ КРС.

РДП. Реакцию ставят по методу Оухтерлони. Выявление преципитирующего АГ ВЧ в органах больного КРС является ценным диагностическим тестом, поскольку этот АГ регулярно появляется в лимфоузлах больных животных, начиная с 1-го дня повышения температуры. На 3-й день болезни он выявляется лишь у 50% больных. РДП, как и РСК, дает быстрый ответ (через 12-18 ч). Оптимальный срок для взятия проб - период от 4-6 дн после начала лихорадки до появления поражений во рту и диареи. Если нет животного в этой стадии болезни, рекомендуют брать образцы от погибшего животного. Для исследования пригоден материал даже от разлагающихся в течение 52 ч трупов, в качестве антител используют гипериммунные сыворотки кроликов и КРС.

Заведомо положительные и отрицательные АГ, приготовленные соответственно от больных и здоровых животных, используют в РДП одновременно. Положительную преци- питирующую сыворотку получают от кроликов, иммунизированных инфицированными кроличьими тканями. РСК, РДП, PH и РНГА являются специфичными и эффективными лабораторными методами выявления АГ и идентификации ВЧ КРС. Однако данные А. Рго\ТО81 и др. (37) показали, что аттенуированные штаммы ВЧ КРС в естественных условиях не стимулируют продуцирование преципитирующего антигена в тканях животных. Это может быть характерным признаком отличия вакцинного штамма от эпизоотического. В Иране в 1982 г. в зонах, где скот был вакцинирован, у привитых животных не обнаруживали образование преципитирующего антигена. Поэтому в зонах систематической вакцинации скота против данной инфекции диагноз поставить сложно (11).

ВИЭОФ. Предложен вместо РДП для быстрой диагностики чумы КРС. В качестве испытуемого АГ служит суспензия селезенки и лимфоузлов толстого кишечника КРС и овец, полученных во время вспышки болезни. ВИЭОФ проводят в 0,8%-ной агарозе на веронало- вом буферном растворе с pH 8,6. Гипериммунную сыворотку помещают в лунки вблизи анода, исследуемый материал - вблизи катода. Пластины помещают в горизонтальную ванночку с охлажденным вероналовым буфером. Линии преципитации образуются через 45 мин при силе тока 6 мА. ВИЭОФ при обнаружении АГ в тканях павших животных он оказался в 4-16 раз чувствительнее РДП и позволяет получить результат в течение 40 мин.

РТГА. Разработана для экспресс-диагностики чумы КРС. Если исследуемый материал содержит вирус, анти-ГА связываются, а их отсутствие или нехватку можно потом выявить, исследуя сыворотку в РТГА с использованием гемагглютинина ВК. При отсутствии вируса в исследуемом материале количество АТ остается неизменным. В этой реакции используют родство АГ ВЧ КРС и ВК. Особую ценность она имеет для диагностики случаев заболевания, вызванных штаммами с ослабленной вирулентностью.

ИФ. В качестве исследуемого материала используют мазки-отпечатки и гистологические срезы (селезенка, лимфоузлы, печень, слизистые оболочки ротовой полости и кишечника) из органов и тканей больных животных или инфицированные этими материалами культуры клеток. Возможно применение непрямого ИФ для обнаружения специфического АГ. Четкие результаты получают в случаях, если ФИТЦ-конъюгат изготовлен на основе гамма-глобулина, выделенного ионообменной хроматографией из специфической сыворотки. Прямая ИФ позволяет обнаруживать АГ в более ранние сроки: в мазках-отпечатках из органов больных животных через 2 ч, в зараженной культуре клеток - на 1 пассаж ранее появления ЦПД - т.е. раньше на 8-10 дн (11). С помощью прямой ИФ возможно оценивать результаты PH в культуре клеток через 24-48 ч после постановки опыта, тогда как для оценки реакции по ЦПД вируса требуется 6-8 сут. Поэтому прямой метод ИФ признан высокоспецифичным, чувствительным и пригодным для экспресс-диагностики чумы КРС (8).

РНГА и РЗГА. Обе реакции позволяют дифференцировать сыворотки и АГ при использовании обработанных дубильной кислотой эритроцитов крови коз. Реакции основаны на адсорбции перекрестных АТ из сыворотки, которая используется в РТГ А (47).

ИФА. ИФА позволяет быстро выявлять АГ ВЧ КРС в патматериале. Наиболее часто АГ выявляли в мазках из поражений слизистой ротовой полости и лимфоузлов. АГ ВЧ наиболее часто выявляли у КРС моложе 3 лет, а у буйволов - в более старшем возрасте. В РДП и ИФА результаты совпадали, но последний позволял получить результат через 2-3 ч. Успешно вирус определяли в назальных и глазных секретах через 4 дн несмотря на то, что он там содержался в количестве не более 1,75 lg ТЦДз0/мл. ИФА оказался более чувствительным по сравнению с выделением ВЧ КРС (45). Получены компоненты набора для диагностики чумы КРС методом твердофазного ИФА, которые обеспечивают обнаружение вирусспецифи- ческого АГ (нуклеопротеина) ВЧ КРС в лизатах зараженных клеточных культур и пробах органов больных животных, а также обеспечивали обнаружение АТ в сыворотках больных и переболевших животных. Чувствительность ТФ ИФА при выявлении специфических антител в сыворотках крови больных и иммунных животных (метод ингибирования) сравнима с чувствительностью РТНГА с использованием эритроцитарного диагностикума на основе монАТ к ВЧ КРС (11а).

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Для обнаружения АТ используют PH, ВИЭОФ, РРГ и ELISA (22). Для серологического исследования берут кровь как можно раньше после установления клинических проявлений и повторно через 10-14 дн. Исследуют парные сыворотки крови не менее чем от 10 животных. ВНА и КСА у животных- реконвалесцентов обнаруживаются через 3-5 дн, поэтому чаще всего применяют РСК и PH. Ретроспективную диагностику чумы КРС проводят в очагах инфекции или при атипичном её течении на вакцинированном поголовье животных, имевших слабый поствакцинальный иммунитет. 4-кратное увеличение титра КСА и ВНА свидетельствует о наличии прошедшей инфекции.

РСК. Применяют чаще всего. На 3-4-й день после снижения температуры у животных обнаруживают КСА в титре от 1:10 до 1:40. На 21-30-й дн достигают максимума и удерживаются в течение 3 мес на уровне 1:80-1:160. Через 8 мес титр их составляет 1:20-1:40.

PH. Можно ставить на кроликах, имея лапинизированный штамм. Учитывая дороговизну этого метода, его используют крайне редко. Реакция в культурах клеток с использованием адаптированных к иим штаммов - метод более простой и дешевый. Для выявления и титрования ВНА метод микротитрования ие уступает пробирочному, но выгодно отличается от него меиыпей чувствительностью к колебаниям дозы. Чтобы избежать цитотоксического и ингибирующего проявления, рекомендуется делать первоначальное разведение сыворотки 1:5. Количественную PH можно проводить в двух вариантах: 1) с постоянной дозой вируса (200-500 ТТТД_«о) и двукратно возрастающими разведениями сыворотки; 2) с постоянной дозой сыворотки (разведение 1:5-1:10) и 10-кратными разведениями вируса lC'-lO'6.

РТГА. В качестве АГ в этой реакции используют вирус кори.

ELISA. Непрямой твердофазный микрометод позволяет обнаруживать АТ к ВЧ КРС. Данные его коррелируют с результатами PH. Считают, что указанный метод можно успешно применять для оценки эпизоотической ситуации и при проведении кампаний по вакцинации животных.

Проведена сравнительная оценка эффективности использования ИФ, ИФА и ВИЭОФ для выявления АТ против чумы КРС у телят, вакцинированных культуральной вирус- вакциной против чумы КРС. Исследования проведены с использованием первичных культур бычьей почки, выращенных на покровных стеклах и инфицированных шт. К90 ВЧ КРС, или с использованием мазков-отпечатков ткани лимфоузлов КРС, зараженного шт. Гиссар. При применении ИФА мазки-отпечатки предварительно обрабатывали антипероксидазной сывороткой для удаления эндогенной пероксидазной активности клеток лимфоузлов. Установлено, что в первые 7 нед после вакцинации у телят удавалось выявить АТ в 100% случаев всеми испытуемыми методами. В последующий период (с 8 до 12 нед после вакцинации) наиболее эффективным был метод ИФ (АТ выявлены у 84,6-100% телят). Менее чувствительными в этот период были методы ИФА и ВИЭОФ (соответственно АТ обнаружены у 23-77,7 и 7,7-77,7% телят). Для определения АТ к ВЧ КРС в Индии успешно применяют метод microELISA. Показаны преимущества конкурентного ELISA со специфическими монАТ над непрямым ELISA (21).

Реакция радиального гемолиза (РРГ)- Рекомендована для обнаружения АТ к ВЧ КРС. В качестве АГ используют суспензию лимфоузлов от зараженных телят. Реакцию ставят на пластинках, куда вносят 2-4 мл 1%-ной агарозы с 0,3 мл конъюгированных с АГ бараньих эритроцитов, обработанных хлоридом хрома и 0,3 мл неразведенного комплемента.

Дифференциальная диагностика. Проводится по данным исследования вируссодержащего материала (гибридизационным тестом, биопробой, серологическими реакциями с видоспецифической сывороткой). В связи с тем, что в некоторых странах, в том числе и в европейских, чума КРС давно ликвидирована, при случайном заносе она может быть ошибочно диагностирована как вирусная диарея или злокачественная катаральная горячка, что необходимо иметь в виду при дифференциальной диагностике чумы.