ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ.

Морфология и химический состав. Размер вириоиов от 120 до 300 нм. Оболочка вирионов имеет выступы нити длиной 8 нм и содержит АГ-компоиенты.

Как патогенные, так и апатогенные штаммы вируса НБ содержат 6 полипептидов: Ъ, НМ, Б, М, КР и полипептид с мол. м. 47000 Д. В составе вируса обнаружены 3 основных и 5 минорных белковых компонентов. В какой степени они соответствуют 6 вышеуказанным полипептидам неизвестно. К основным относятся гемагглютинин, белок внутренней оболочки и белок РНП. Нейраминидаза - один из минорных компонентов. Кроме этого, в вирионах вируса НБ обнаружена эндорибонуклеаза, а в вирусе, полученном из хронически инфицированных клеток Ъ, РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза). Возможно, имеется связь между наличием обратной транскриптазы и способностью вируса вызывать хронически протекающую инфекцию. Очищенный нуклеокапсид не обладает РНК-полиме- разной активностью, так как не содержит необходимых белков, либо в процессе приготовления препарата нуклеокапсидов инактивируется сам энзим.

Вирионные и целлюлярные полипептиды, обладающие одинаковой электрофоретической подвижностью, идентичны. Неспецифичный вирусный гликопротеин Бо, обнаруженный только в зараженных клетках, родствен малому вирионному гликопротеиду Б.

Устойчивость. Инфекционность, гемагглютинирующая активность и иммуногенность вируса разрушаются при 56°С в период 5 мин -6 ч. При 37°С эти изменения наступают через несколько часов и даже дней, при 20 и 8°С для утраты вирусом своей биологической активности нужны месяцы и даже годы. Вирус устойчив к низкой температуре, в замороженном состоянии активность его сохраняется более 2-х лет. Нет корреляции между уровнем вирулентности и ГА-активности штаммов вируса при прогревании. Вирус устойчив к pH в диапазоне от 2 до 10, быстро разрушается при воздействии ультразвука. Р-ры формалина (1- 2%-ные), гидроксида натрия (1-2%-ные), мыльного крезола (1%-ный) и фенола (3-4%-ные) его быстро убивают.

Стабильность вируса в значительной мере зависит от среды, в которой он находится. Под воздействием дневного света инфекционность его снижается за 4 ч на 3-5 Г А свойства сохраняются при более длительной инактивации, чем инфекционные. Установлено, что висцеротропные велогенные штаммы обладают термочувствительным, а лентогенные - термостабильным ГА, т.е. вирулентность штаммов прямо не связана с термостабильностью ГА.

Антигенная структура. Вирус содержит гемагглютинин и нейраминидазу, М-, Б-белки и Б (РНП) - антигены, различающиеся по локализации в вирионе, иммуногенности и АГ- активности. Каждый вирион содержит определенное число идентичных молекул НМ, каждая молекула НЫ содержит 2 домена: НА и ЫА. Каждый домен содержит идентичные или отличные друг от друга АГ-детерминанты (эпитопы) (30).

Различия в вирулентности штаммов вируса НБ связаны с изменением в структуре HN- гена, кодирующего ГА-нейраминидазу. Большинство аминокислотных замен располагается в четырех участках N-конца HN-белка (40). Имеются данные, свидетельствующие о связи вирулентности вируса НБ с расщеплением гликопротеина слияния (белка Fo) клеточными прогеазами (28,31), или изменением других свойств белков F и HN (37).

Антигенная активность. Гликопротеидный ГА-нейраминидазный комплекс вируса (шт. La-Sota) обладает выраженной АГ- и протективной активностью на курах. Большинство исследованных клонов монАТ против ГА-нейраминидазы вируса НБ в равной степени вызывают оба варианта слияния (43).

Антигенная вариабельность и родство. Подавляющее большинство полевых и вакцинных штаммов вируса НБ в АГ - и иммунобиологическом отношениях сходно. Некоторые природно-ослабленные штаммы (F, Bl, La Sota, КД, Beaudette, Бор/74/ВГНКИ и др.) широко используют в качестве живых вакцин. Установлено различие природных штаммов не только в вирулентности, но и значительное различие в тропизме к нервной, легочной и энтеральной тканям. Показано, что при серийном пассировании (37°С, 120 ч) неразведенного вируса НБ в КЭ продуцируется избыточное (по отношению к контрольному вирусу) количество ГА; образование “неинфекционных” частиц является, вероятно, следствием множественной инфекции клеток; неинфекционный ГА формируется в результате интерференции при созревании активного вируса с вирусом неполным, инфекционность вируса более чувствительна к термальной инактивации, чем его ГА-активность (44).

Локализация вируса. Вирус локализуется в паренхиматозных органах, костном и головном мозге, мышцах, трахеальной слизи, толстом и тонком кишечниках, содержится в различных выделениях. В период выраженной клинической картины болезни в изобилии выделяется во внешнюю среду с фекалиями, трахеальной слизью и выдыхаемым воздухом. Вирус, как правило, можно выделить только в начале болезни. Переболевшие птицы могут долго быть вирусоносителями.

В организме неиммунных птиц велогенный вирус НБ обнаруживался через 24-48 ч и далее в течение 10 дн во всех органах и тканях. У иммунных или частично иммунных птиц наиболее продолжительное время (19 дн) вирус выделяли из железистого желудка, лимфоидных образований слепой кишки, фабрициевой сумки и мозга. Поскольку ни один из указанных органов не отличался в отношении тропизма вируса, то в полевой диагностике рекомендуется исследовать все четыре органа. Не отмечено гибели среди групп птиц с высоким и низким уровнем иммунитета, на основании чего сделан вывод, что в странах, где проводится поголовная вакцинация или, где распространены лентогенные штаммы вируса, появление велогенного штамма может пройти не замеченным (33).

При наличии циркулирующих АТ вирус иногда удается выделить из мозга переболевших птиц. Показано, что вирулентные штаммы могут бессимптомно персистировать в организме иммунных птиц в течение 70 дн. Нет зависимости между титрами анти-ГА и степенью выделения вируса во внешнюю среду. С увеличением продолжительности вирусоноси- тельства (выше 70 дн) вирулентность исходных штаммов вируса снижается независимо от первоначального титра анти-ГА, однако латентная форма инфекции может свободно переходить в клинически выраженную. Было показано, что после заражения иммунизированной птицы велогенным вирусом возможно носительство и выделение последнего в течение 14-17 дн, т.е. поствакцинальный иммунитет не исключает циркуляции дикого вело- или мезоген- ного вируса. Возможность длительной персистеиции вирулентного вируса в организме вакцинированной птицы может обусловливать возникновение вирусоиосительства (13).

Изучено in vitro связывание шт. V4 вируса НБ с клетками различных отделов пищеварительного тракта цыплят. Оказалось, что энтероциты 12-перстиой, тощей, повздошиой, слепой и прямой кишок связывали 97, 85, 99, 92 и 90% вируса соответственно, в то же время к энтероцитам пищевода, зоба и железистого желудка вирус не прикреплялся, поэтому и ннфекционность супернатанта не изменялась.

Антигенная активность. Все формы НБ вызываются идентичными в АГ-отношении штаммами и протекают с образованием ВНА, анти-Г А и КСА. В сыворотке птиц АТ появляются через 6-10 дн после заражения, пока еще у больной птицы проявляются клинические признаки болезии. Наивысший титр их отмечают через 3-4 нед. Снижение титра АТ обычно происходит медленно и становится заметным через 3-4 мес, а спустя 8-12 мес АТ уже ие выявляются. Установлена корреляция между анти-Г А и ПА. Низкий процент птиц (до 12) с ПА указывает на наличие в стаде выраженного иммунитета против НБ, а высокий процент (более 50) свидетельствует о персистентной инфекции.

Получены раздельно АТ на гликопротеин ГА-нейраминидазы (ГП-ГН) и на гликопротеин слияния (ГП-С). Первые из них подавляют ГА- и нейраминидазную активность вируса НБ и тормозят его гемолитическое действие, АТ иа ГП-С не влияют на его первые две активности, но подавляют его гемолитическую активность и тормозят эффект вирусиндуциро- ванного слияния клеток. Шт. 575, выделенный от диких лебедей и королевских крачек в Канаде, обладал уникальной способностью вызывать образование не только анти-Г А, но и АТ, блокирующих элюцию вируса с эритроцитов.

Экспериментальная инфекция. Легко воспроизводится на курах, цыплятах и индюшатах вирулентными штаммами при любом методе заражения. Вся зараженная велогенны- ми штаммами птица, не имеющая пассивных материнских АТ, погибает. Мезогенные штаммы (подобные вакцинному вирусу Н) вызывают летальный исход у цыплят до 45-60- суг возраста. Среди взрослой птицы отход достигает 25-30%. Чаще наблюдают параличи и парезы. У кур-несушек яйценоскость прекращается иа 25-30-й день.

Лентогенные штаммы (Bl, F, La Sota, Бор/74/ВГНКИ) вызывают у цыплят слабую или инаппарантную форму болезни. Даже при интрацеребральиом заражении цыплята не гибнут, КЭ также обычно не гибнут ранее 100 ч после введения минимальной летальной дозы.

Кроме кур и цыплят к экспериментальному заражению восприимчивы перепела, воробьи, тетерева, голуби. При парентеральном заражении некоторые штаммы оказались патогенными для морских свинок, кошек, собак и других млекопитающих. Интраназально и ин- трацеребрально удается заразить и золотистых хомячков. Вопрос о трансвариальной передаче вируса НБ однозначно не решен. Однако факты последних лет свидетельствуют о возможности такой передачи. Так, например, в содержимом желудка очень молодых невакци- нироваиных цыплят были обнаружены лентогенные штаммы вируса. Последний обнаруживался даже в КЭ, несмотря на присутствие материнских АТ. Поствакцинальные титры АТ низки и вариабельны у цыплят, предварительно инфицированных вирусом НБ (34).

Культивирование. Помимо восприимчивой птицы вирус культивируется в КЭ при любом способе заражения, иа изолированных ХАО, в культуре фибробластов КЭ, некоторых первичных и перевиваемых клетках.

Через 48 ч вирус (шт. R2B) накапливался в значительных количествах в ХАО и в низких титрах определялся в аллантоисно-амниотической жидкости. Если эмбрионы инкубируют до 60 ч, то вирус выходил из ткани мембран и в больших количествах накапливался в экстраэмбриональной жидкости (15). В клетках ВНК-21 М-белок вируса НБ обнаруживался в цитоплазме с 5-го ч после инфицирования (22). При совместном культивировании в КЭ шт. La-Sota вируса НБ и шт. ЦНИИПП клон НТ вируса ИЛТ синергизма и интерференции не отмечено, т.е. накопление вирусов было таким же как и при монокультивировании.

Цитопатология заражённой культуры клеток. Вирус развивается в культурах клеток 18 первичных и 11 перевиваемых линий, вызывая цитологические изменения. Репродукция его в культуре тканей сопровождается уплотнением цитоплазмы клеток, появлением в них вакуолей и вирусных частиц. Через 40 ч в цитоплазме некоторых клеток обнаруживали множество малых аморфных эозинофильных включений, окруженных прозрачной зоной. В одной клетке могло быть до 12 (и более) таких включений. Через 2 дня в зараженных культурах увеличивалось количество клеток с пикнотическим ядром, а через 7 дн поражались все клетки.

ГА свойства. Вирус агглютинирует эритроциты амфибий, рептилий, птиц, человека, мышей и морских свинок. Эритроциты КРС, овец, коз, свиней и лошадей агглютинируются не всеми штаммами вируса. Разнообразие в аггяютинабельности эритроцитов КРС зависит от ионной силы, концентрации солей и pH р-ра. Инагглютинабельность эритроцитов опре- , деленных видов объясняется, вероятно, быстрой элюцией с них вируса. Приблизительно 105 инфекционных единиц (ИД50) вируса равны 1 ГА. Некоторые штаммы вируса теряют ГА- активность при 56°С за 5 мин, сохраняя инфекционные свойства, другие, наоборот, сохраняют ГА-способность после прогревания при 56°С в течение 180-240 мин, а инфекционная активность их утрачивается через 90 мин. Для отдельных штаммов НБ характерна определенная температура, при которой они утрачивают Г A-активность. Эго свойство можно использовать для дифференциации штаммов. ГА лентогенного шт. В1 в инфицированных клетках ХАО накапливаются к 12 ч культивирования в более низких титрах (1:16 - 1:32), чем ГА велогенного (Т/53) штамма (1:64 - 1:128).

Вирус НБ, выращенный в КЭ, состоит из инфекционных и неинфекционных ГА частиц. У этих 2 типов частиц изучены структурные белки, ГА- и нейраминидазная активности, по- липептидный состав жирных кислот в липидах мембраны. Фиксация эритроцитов цыплят глютеральдегидом не снижает их агглютинабельности по отношению к вирусу НБ. Фиксированные таким образом эритроциты можно использовать в РГА и РТГА после хранения при температуре 4°С в течение 2 мес. Велогенные штаммы отличаются от лентогенных по ГА-свойствам. Оптимальный режим для дифференциации указанных возбудителей - обработка их в течение 1 ч азотистой кислотой при pH 4 и температуре 37°С,

Нейраминидазная активность. Выявлена обратная корреляция между нейроминидаз- ной активностью и вирулентностью штаммов вируса. Считают, что параметры энзиматической активности могут являться маркерами вирулентности вируса in vivo.

Гемолитические свойства. Все штаммы вируса обладают гемолитической активностью по отношению к эритроцитам морских свинок, лошадей и кур, которая не связана с вирулентными свойствами и находится в прямой зависимости от Г А-титра вируса. Однако имеется и противоположное мнение. По гемолитической активности штаммы вируса НБ можно разделить на слабоактивные (S и М) и высокоактивные (Т, Н и В). На гемолитические свойства вируса влияют концентрация солей, pH и температура среды, вид эритроцитов. При 4°С она резко снижается. Гемолитические свойства вируса можно инактивировать специфической антисывороткой и формалином.

Токсические свойства. Токсичность вируса зависит от метода введения вируса: интра- церебрально, интраназально, внутривенно. У кроликов, зараженных в мозг, в первые 2 дн развиваются параличи, и к исходу 3 сут животные гибнут. При внутривенном заражении кроликов вирус вызывает пирогенную реакцию, могут появиться лимфоцитопения и лихорадка. У мышей при интраназальном введении развивается летальная пневмония, а после нескольких повторных интраназальных введений - гепатизация легких. После 1-кратного замораживания-оттаивания вируссодержащей экстраэмбриональной жидкости или обработки ее in vitro гомологичной иммуносывороткой токсические свойства вируса исчезают.

Интерфероногенные свойства. Многие штаммы, особенно шт. Н, - хорошие индукторы интерферона. Выделены ts-мутанты этого вируса и изучена их способность индуцировать интерферон в первичных клетках КЭ. Показано, что 5% вирусного генома, связанного с ин- фекционностью, необходимо для индукции интерферона. Существенную роль в индукции интерферона играет ранняя транскрипция (2-3 ч после заражения) генома вируса. Способность индуцировать интерферон у иитактных вирионов НБ, инактивированных ?-пропио- лактоном от вирионов и некоторых структурных компонентов сравнивали в тест-системе Р/3 ML - интерферон продуцирующих клеток (60).

Вирулентные свойства. По вирулентным свойствам все выделенные и охарактеризованные штаммы вируса НБ разделяются на велогенные (Т, Сато, Миадера и др.), мезоген- ные (Н, Комаров, Муктесвар, Роакин и др.) и лентогенные (В 1, F, La Sota, Бор/74/ВГНКИ).

Велогенные штаммы отличаются от лентогенных по уровню репродукции и спектру ин- вазивности. Они накапливаются в органах больных цыплят (легкие, селезенка, печень, мозг) в концентрации 5,5 lg ЭЛД50/г, лентогенные же штаммы (Bl, La Sota) в мозге ие выявляются, а уровень накопления в легких и селезенке не превышает 2,5 lg ЭЛД 50/г. ЦПА велоген- ных штаммов обычно соответствует инфекционности для КЭ, тогда как лентогенные штаммы ЦПА не обладают (25а).

С помощью метода фингерпринта можно идентифицировать высокопатогенные штаммы вируса, имеющие очень близкое АГ родство, а также определять корреляцию между наличием специфических олигонуклеотидов и патогенностью. Разработан культуральнотканевый метод дифференциации мезо- велогенного и других штаммов вируса НБ, основанного на изучении характеристики ЦПД штаммов вируса, их инфекционных титров в культуре клеток LSGFS-SF3. Лентогенные штаммы в этой культуре клеток продуцируются в низком титре и ЦПД их слабо выражено (1, 2). Получены также монАТ, пригодные для штам- мовой дифференциации. Для дифференциации лентогенных штаммов вируса НБ применяют РГА - элюции. Эти штаммы можно разделить на две группы: быстро (-24R) и медленно (+24R+) элюирующие. Кроме того, используют тест термостабильности ГА и среднюю смертность зараженных КЭ (1,2).