ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ

Морфология и химический состав. РВС безоболочечный, имеющий различные колесообразные структуры при электронной микроскопии негативно контрастированных препаратов. Полные РВ частицы имеют хорошо различимые внутренние ободки, характерные для рео- и орбивирусов семейства Reoviridae. Вирусные частицы с “двойным” кяпгидом обладают внешним капсидным слоем, внутренним капсидным слоем и икосаэдральным ядром. Размер около 75 нм в диаметре. Вирионов с одинарным капсидом около 60 нм. Диаметр ядра около 52 нм и содержит вирусный геном и РНК-зависимую РНК-полимеразу. Инфекци- онностью обладают только вирионы с двойным капсидом (58). Плавучая плотность 2- слойных, 1-слойных и ядерных частиц в хлористом цезии составляет 1,36 1,38 и 1,44 г/см3 соответственно (6). Геном РВС представлен 2-нитевой РНК с 11 сегментами. Общий молекулярный размер составляет приблизительно 18522 п.о. (66, 20). Ген 6 РВС шт.УМ состоит из 1356 нуклеотидов и кодирует белок VP6, состоящий из 397 аминокислот и образующий внутреннюю оболочку вириона. Он содержит групповые и подгрупповые эпитопы. Ген 10 шт. VM кодирует белок N528, который состоит из 175 аминокислот. Выявлена наибольшая гомология белка с РВ человека Wa, тогда как другие белки этих вирусов сильно различались. Белок VP6 шт.УМ ближе к белку подгруппы II, чем подгруппы 1. Это позволило идентифицировать 5 возможных аминокислот VP6, которые могут определять АГ подгрупп. РНК сегментирована на 4 зоны (I-IV). Группа А РВС имеет 4:2:3:2 сегментов в зонах I, II, III и IV соответственно. Для группы В расположение сегментов 4:2:2:3 и для группы С - 4:3:2:2. В группе Е количество сегментов в зонах подобно группе В, за исключением сегментов 7-11, подвижность которых отличалась от других (65). Выявлена корреляция между электрофоретипом и серо- группами, однако подчеркивается, что серологические исследования - более достоверны.

Антигенная структура. Внутренний капсид состоит из 2 главных белков - VP2 и VP6. Последний содержит групповой и субгрупповой АГ. Недавно показано, что эпитопы суб- групповой специфичности могут также локализоваться в белке VP2 (78, 79). Наружний капсид содержит 2 поверхностных протеина VP4 и VP7 (20). Белок VP4 до 1987 г. относился к белку VP3) (41) негликозилирован, содержит ГА, играет важную роль в инфекционности и вирулентности (27, 28, 37, 52). Протеолитическое расщепление VP4 на VP5 и VP8 важно для проявления инфекционности вируса. Это закодировано в 4-м сегменте генома. Белок VP7 - 2-ой по важности структурный белок, имеет мол.м. 37кД, гликозилирован, кодируется другим сегментом гена (7-м или 9-м в зависимости от штамма вируса), VP4 и VP7 индуцируют ВНА (27, 28, 52), которые важны в плане индукции иммунитета (52) и независимы друг от друга (31, 32). Возможны реассортантные штаммы РВ, содержащие некоторые комбинации Р и G-типов. Один из таких шт. SBI-A с G4 и Р7 типом уже описан (33,44).

Некоторые штаммы РВС имеют ГА и агглютинируют эритроциты человека 0 группы, морских свинок и крыс (18а, 60, 61, 62).

Антигенная вариабельность и родство. Первоначально было показано, что РВ разных видов животных имеют общий групповой АГ (20). Позднее показали, что РВ серологически отличаются (9, 69, 1, 42а). Стало очевидным, что РВ отличаются в АГ отношении от РВ, похожих на классические РВ, но утративших общий групповой АГ (9, 69,1, 42а). Такие РВ называли “новыми ротавирусами”, ротаподобными вирусами, параротавирусами, атипичными вирусами и АГ отличающимися вирусами (1, 9, 10, 69, 42а, 68, 73, 81, 64, 65,). Серо- группы с общим групповым АГ внутреннего капсида идентифицированы в серологических реакциях ИФ, ИФА, или ИЭМ (1, 9,10,13, 42а, 64, 65, 69,73, 81).

Было выявлено 7 различных серогрупп (A-G), 4 из которых поражают свиней (10, 65). Группа А ротавирусов наиболее изучена и наиболее связана с гастроэнтеритами свиней. Диарею у свиней чаще всего выбывают вирусы группы А. Они имеют 2 поверхностных белка - VP4 (вирус типа Р) и VP7 (вирусы типа G). Известно 13 G-типов и 12 P-типов ротавирусов А. Группа В ротавирусов относится к отличающимся РВ или ротаподобным вирусам и обнаружена у свиней, телят, людей. Группа С также определяется как параротавирусы, обнаружена у поросят и людей (19). Шт. Cowden с помощью теста двойной перекрестной PH РВ группы С свиней и шт. Shiutoku группы С бычьего типа были классифицированы как различные серотипы. Другой штамм РВ группы С свиней (HF) не реагировал со шт. Cowden u Shiutoka, он принадлежал к серотипу J. Приведенные данные подтверждают существование, по меньшей мере, 2-х различных серотипов Р группы С, а возможно и 3-го серотипа у животных и человека.

Группа Е обнаружена у поросят только в Великобритании (13), тогда как группы D, F и G обнаружены у цыплят и индеек (10, 65). Глава 1. Family Reoviridae Реовирусные инфекции РВ группы А подразделяются на субгруппы Si и Sn и серотипы (27). Вирусы дополнительных субгрупп могут преобладать в природе (78). Серотипы в серогруппах определяются в реакциях подавления бляшкообразования или подавления флюоресцирующих фокусов ги- периммунными сыворотками (8, 59). Необходимо 20-кратное различие в титре ВНА между гомологичными и гетерологичными РВ, чтобы установить различающийся серотип. Описано 11 серотипов (20). Серотипирование является комплексным и иногда дает двусмысленные результаты, обусловленные вовлечением 2-х поверхностных белков VP4 и VP7, которые индуцируют образование ВНА (27, 28). Генетический код этих поверхностных белков выделяется независимо друг от друга (31, 32). Белок VP7 обозначается как G тип гликопротеина, тогда как VP4 - как Р, протеазочувствительный белок. РВС обозначается следующим образом: группа/штамм/субгруппа/G тип/Р тип. Недавно описано 5 серотипов по G группе (VP7) РВС (8, 45, 46, 60, 61, 62). Данные о G-типе и других серотипах РВС представлены в таблице I. 4. По крайней мере 2 P-типа (VP4) обнаружены среди РВС, однако данных об этой группе пока недостаточно. МонАТ и РНК-зонды делают возможным получение информации и типирование G- и P-типов РВС в ближайшем будущем (36,38,60,61,67).

Таблица L4. Серогруппы и серотипы изолятов РВС Серогру

ппы Штамм Серотип VP7 (G)a Серотип VP4 (P)a Обозначения других серотипов Ссылк А OSU 5 7 Свиной серотип 1 Gottfried 4 6 Свиной серотип 2 SB1-A 4 7 Естественный реассортант CRW-8 3 ? ISU-64 Подоб.9 7 ISU-65 3 7 YM 11 ? В Ohio N1RD-1 1А1146 С Cowden 1A850 Е DC-9 На основании химических свойств по Estes и Cohen, 1989 г.( 20 ).

Общим групповым АГ является белок VP6 внутреннего капсида (20). В перекрестной PH выявлено родство между РВ обезьян и свиней, а также между ними и РВ КРС. Однако РВС родственны с РВ человека.

Все 4 штамма РВС, выделенные в Китае, были разделены на 2 различных серотипа: один (41) нейтрализовался до высоких титров антисывороткой против референс-шт. OSU и возможно был сходен с OSU (серотип 1-й РВС), другие 3 штамма (Lin 71, Nan 86, Jiang 150) были АГ отличимы от Li 99 и не реагировали с антисывороткой против OSU. Они характеризовались как РВС серотипа 2. Не выявлено также АГ-родства между РВС и РВ КРС. РВ свиней (шт. РО-13) нейтрализуется антисывороткой прототипного серотипа 7 того же вируса (urr. Ch 2), поражающего птиц. При анализе геномов вирусов установлена их близость в РНК-РНК гибридизации.

Культивирование. Культивирование РВС сложно. К перевиваемьм линиям клеток вирус был адаптирован с предварительной обработкой вирионов трипсином (10 мг/мл в течение 30 мин) перед заражением или панкреатином (81). Позднее вирус успешно размножали в культуре клеток MA-104 (8). Используя эти приемы проводят и изоляцию РВС. Клеточноадаптированные РВС вызывают ЦПИ, характеризующиеся округлением клеток и последующим отделением их от стекла. Вирусный АГ обнаруживается в цитоплазме ИФ или им-

Г лава 1. Family Reoviridae Реовирусные инфекции мунохимическим методом. РВС образуют бляшки под агаровым покрытием в присутствие нейтрального красного.

Описано размножение одного штамма РВС группы С в первичной культуре клеток поросят (80). При этом необходимо добавление в культуральную среду высокой концентрации панкреатина. После 9 пассажей в первичной культуре клеток почки поросенка штамм адаптировался к культуре МА-104 (70).

Экспериментальная инфекция. Использование поросят-гнотобиотов или поросят, не получавших молозива позволило стабильно воспроизводить клиническое заболевание РВИС. Наиболее тяжело протекает при заражении в 1-5 - дн возрасте (42, 48). После инкубационного периода в 12-24 ч поросята теряют аппетит, становятся угнетенными и вялыми. Тяжелая, профузная диарея наступает через 1-4 ч. Каловые массы водянистые, от желтого до белого цвета, разной консистенции. Диарея продолжается 3-5 дн, затем кал постепенно в течение 7-14 дн. становится нормальным. Наблюдается обезвоживание поросят и возможна смерть на 2-5-й день после начала поноса; смертность может достигать 50-100%. Диарея и обезвоживание слабее при заражении поросят в 7-21-дн возрасте (72). При заражении поросят в 28-дн возрасте заболевание ограничивается проходящей диареей (40, 82, 83). Смертность снижается с возрастом и, как правило, редко наступает при заражении после 14 дн. Клинические признаки практически отсутствуют когда 21-28-ди поросят выдерживают на сухой диете в течение по крайней мере 3-х дн после заражения (74, 75, 81, 82).

Роль РВС в послеотъемной диарее поросят не совсем ясна. В ряде случаев РВС являются первичной причиной тяжелой диареи у недавно отнятых от матерей поросят и приводят к 10-50% смертности (85), в других случаях РВС не вызывают таких поражений. При ассоциации РВС с ТГС или гемолитической энтеротоксигенной E.coli развивается тяжелая диарея. Заражение поросят-отъемышей РВС в сочетании с E.coli подтверждает ведущую роль РВС в патогенезе диареи (40, 81, 82).

При инокуляция поросят серотипами 4, 5 и новыми серотипами (шт. ISU-64) воспроизводилась одинаковая клиническая и патологоанатомическая картина заболевания (3, 4, 5, 8, 34,35, 74, 75). Различий в патогенности штаммов группы А не установлено (14).

Заражение поросят-гнотобиотов РВС группы С обусловливало заболевание, аналогичное таковому группы А, тогда как РВС групп В и Е вызывали менее тяжелую диарею и в более короткий период (7, 9,10,11, 12,13, 73,81).

ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

Источники и пути распространения инфекции. Серологические исследования показали высокий процент серопозитивности (77-100%) взрослого свинопоголовья к группам А, В и С (11) У поросят 3-8-нед возраста процент серопозитивности к группам В и С сильно варьирует, тогда как к группе А он всегда высок. Циркуляция РВ, как правило, энзоотичиа. Вирус распространяется фекально-оральным путем. Поросята обычно заражаются на 7-41-й день. РВИС обусловлено около 14% диарей свиней. Из 90 случаев РВИ 67% были обусловлены группой А, 10 - В, 12 - С и 11% - смешанной инфекцией (35, 60,61, 62).

Большой интерес представляет инаппарантная (бессимптомная, латентная) форма РВИС, которая характеризуется персистированием в организме определенного количества вируса при отсутствии клинических признаков гастроэнтерита и обнаружении РВС в фекалиях внешне здоровых животных. Известный шт. СА-11 был получен от здоровой обезьяны.

Выявить РВС (РДП и ЭМ) при инаппарантной форме инфекции не всегда удается. Выявление АТ к РВС свидетельствует о контакте организма с этим возбудителем, однако АТ могли остаться и у реконвалесцентов. Поэтому необходим точный ретроспективный анализ ситуации в хозяйстве (данные о РВ гастроэнтерите с клиническими признаками или без них

Глава 1. Family Reoviridae Реовирусные инфекции за последние 2-3 года). Чтобы точно определить ту или иную форму болезни, исследование АТ к РВ следует проводить у поросят-отъемышей, которые находились под наблюдением в течение 1 мес со дня рождения. Обнаружение АТ при отсутствии клинических признаков может служить основанием для диагноза - инаппарантная форма инфекции.

Данную форму болезни трудно диагностировать в хозяйствах, где у животных имелись АТ к РВ и отмечали клинические признаки гастроэнтерита, которые могли быть вызваны другими вирусами (энтеро-, корона-, адено-, парво-, астровирусами) и бактериальными агентами, а также погрешностями в кормлении. В этих условиях необходимо установить наличие АТ к РВС. Если болезнь вызвана другими этиологическими АГ или погрешностями в кормлении, то вероятность инаппарантной РВИС увеличивается.

Положительный ответ по РДП всегда соответствовал клиническим проявлениям болезни как в эксперименте, так и в эпизоотических условиях. Инаппарантная РВИС может быть обусловлена рядом факторов. Во-первых, наличием низковирулентной популяции РВ (дефектные или 1-капсидные частицы), которая при отсутствии других негативных факторов не может проявить патогенность. Во-вторых, частицы РВ становятся инфекционными, если полипептид VP3 расщепляется на VP5 и VP8 под действием протеолитических ферментов. При недостаточном количестве их или низкой активности не происходит активизация рота- вирусных частиц и, как следствие, возникает инаппарантная форма болезни, которая играет большую роль в эпизоотическом процессе.

Энтероциты тонкого и толстого отделов кишечника обладают разной чувствительностью к РВ. У 2-4-дн поросят к инфекции устойчивы энтероциты тонкого кишечника, а у 4-8-дн - тонкого и толстого. Вероятно, резистентность к РВИС связна со специфическими рецепторами для вируса, число которых в тонком кишечнике с возрастом уменьшается. Однако, РВС поражает поросят и после отъема их от взрослых свиней.

ДИАГНОСТИКА

Для диагностических исследований отбирают образцы кала гаи содержимого кишечника при остром заболевании. Наибольшая концентрация РВС отмечается в течение 12-24 ч после начала диареи (9, 60, 81).

Для выявления РВС используют ряд методов, включая ЭМ, ИЭМ, ИФА, изоляцию, реакцию латекс-агглютинации, дот-блот-гибридизации, РНК-электрофоретипирование.

Индикация вируса

ЭМ и ИЭМ. Эго основной метод выявления вируса. Он позволяет обнаруживать различные группы РВ. Морфология и тип вирусных частиц, обнаруживаемые в негативно кон- трастированных препаратах, изменяются при окрашивании и зависят от серогрупп РВС. Негативное окрашивание фосфорно-вольфрамовой кислотой (ФВК) при нейтральном pH выявляет предпочтительно 1-слойные капсиды, тогда как ФВК при pH 4,5 или уранилацетат выявляют 2-слойные частицы (47,76). Ядро частиц выявляется у РВС группы В (12, 81). ИЭМ позволяет дифференцировать различные серогруппы РВС.

ИФА. Часто используется для выявления вирусспецифического АГ в фекалиях или содержимом кишечника и более чувствителен, чем латекс-агглютинация (26), но менее чувствителен чем ЭМ (3, 4, 5). Электрофоретипирование вирусной РНК часто используется для обнаружения и дифференциации серогрупп РВС, но эти результаты должны быть подтверждены серологически. Дот-блот-гибридизация используется как альтернатива для индикации и идентификации групп РВ и их серотипов (17,36, 60, 61,62, 67).

Выделение вируса. У 90-100% поросят до 5-6-нед возраста молено обнаружить РВ в фекалиях. Продолжительность экскреции вируса, как правило, не превышает 1 нед. Изоляты получены из фекалий в клеточных культурах (клетки МА-104). На различном числе пассажей наблюдался типичный ЦПЭ, вирусный АГ обнаруживали в цитоплазме инфицирован-

Глава 1. Family Reoviridae Реовирусные инфекции ных клеток в ИФ. Адаптация РВ к клеточным культурам подтверждена также с помощью методов ЭМ и ИФА.

Серологическая диагностика. Разработан метод гемагглютинации и РТГА с РВС (nrr.S-80). ГА вируса получают при репродукции его в клетках МА-104, предварительно обработанных трипсином. Вирус агглютинирует эритроциты человека типа А, В и О, морской свинки и свиней. Титр РГА с эритроцитами морской свинки равеи 1:8 - 1:128. Максимальный титр ГА отмечен при инкубации вируса с эритроцитами в течение ночи при 4°С. Титр АТ к РВ со шт. S-80 в РТГА достигает 1:320 и коррелирует с PH (г~0,66). Серологическая (ретроспективная) диагностика имеет небольшое значение в диагностике РВИС, поскольку АТ широко распространены в стаде. Однако титр АТ и серотип отражают иммунный статус животных. Помимо вышеописанной реакции АТ к РВС могут выявляться в непрямой ИФ. Для этого линию клеток МА-104 заражают одной из групп РВС (А, В или С). После культивирования клетки фиксируют в смеси ацетон-метанол и используют в качестве АГ в непрямой ИФ. С этой же целью можно использовать криосрезы слизистой оболочки кишечника больных поросят. В непрямой ИФА и РТГА обычно выявляют АТ к групповому АГ. ИФА, комбинированный с типоспецифическими монАТ, используют для определения классов АТ к РВС (58-62). ВНА выявляются в реакциях подавления бляшкообразования или подавления фокусов ИФ (59).