ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ

Морфология и химический состав. Установлено наличие 8 вирусспецифических белков (VP1-VP8) с мол. м. от 120кД (VP1) до 230кД (VP8). Геном вируса представлен 1- нитевой РНК, состоящей из 9800±200 нуклеотидов. Идентифицированы структурные и неструктурные полипептиды и кодирующие их участки генома (63). В геномах обоих шт. ВД в области кодирования неструктурного белка р125 обнаружены небольшие вставки клеточных последовательностей, отсутствующие в штаммах вируса КЧС. Вставка, идентифицированная в шт. Ослосс ВД-БС кодирует полный элемент, похожий на убиквитин. Вставка в геноме шт. NADL не имеет гомологии с геном убиквитина, но почти полностью идентична последовательности другой мРНК КРС. Ген белка р80 шт. Osloss ВД КРС амплифицирован методом ПЦР и клонирован в E.coli на плазмидном векторе под контролем просмотра фага Т7. Экспрессия р80 в E.coli вызывает образование цитоплазматических телец-включений, которые денатурировались мочевиной и ренатурировались диализом (85а, 86,102).

Устойчивость. Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, трипсину и дезоксихолату. Быстро инактивируется при pH 3. При изменении pH среды от 5,7 до 9,3 инфекционность его снижается, он наиболее устойчив при рН7,4; переносит температуру 4°С, годами сохраняет активность при температуре ниже -20°С. ВД КРС обладает высокой устойчивостью, хорошо сохраняется в нативном виде без добавления стабилизирующих р-ров при 4°, -20°, - 40°С и в лиофилизированном состоянии, восстанавливая заданные характеристики (8а).

Однако имеются сообщения, что при -20° С некоторые штаммы вируса быстро гибнут, а последовательное замораживание и оттаивание ведет к инактивации. В культуральной жидкости при -15°С вирус активен до года; в крови, лимфоузлах, селезенке и другом патологическом материале сохраняется до 6 мес; при 37°С погибает через 5 дн.

Антигенная структура. В структуре VP3 вируса выявлено 3 АГ-участка, один из которых оказался высоко консервативным нейтрализующим эпитопом (40). Только монАТ к консервативному эпитопу ВД узнают все изоляты этого вируса и не реагируют с изолятами вирусов КЧС и пограничной болезни (109).

Геном шт. Osloss представляет собой (+) нить РНК длиной 12480 нуклеотидов и может кодировать полипротеин из 3975 аминокислотных остатков. Получены данные, подтверждающие возможность различать близкородственные пестивирусы мелких жвачных, вирус ПБО и ВД КРС (113а). Гликопротеин 53-58 кД является основным белком, ответственным за выработку ВНА у инфицированных (151,152) и вакцинированных животных (45а). С помощью монАТ дифференцировано два биотипа ВД КРС - цитопатогенный и нецигопатоген- ный. В организме персистентно инфицированных животных нецитопатогенные штаммы вируса могут превращаться в цитопалгогенные путем включения клеточных последовательностей в геном вируса в результате рекомбинации (114а). Первоначально нецитопатогенный вирус заражает плод и приводит к развитию персистентной виремии у телят. У последних с персистентной виремией хроническая болезнь может развиваться вследствие суперинфекции гетерологичным цитопатогенным биотопом вируса (53).

Недавняя оценка патогенности цитопатогенного и нецитопатогенного биотопов ВД привела к выявлению детерминации цитопатогенности. Полагают, что цитопатогенный биотип вируса возник в результате мутации от низко патогенного биотипа в организме персистентно инфицированных животных (95), причем эта мутация, видимо, расположена в гене вирусной протеазы, которая ответственна за расщепление полипептида предшественника (67а). Генетические различия между цитопатогенным и нецитопатогенным штаммами вируса проявляются экспрессией цитопатогенного штамма, содержащего белок р80 в зараженных клетках.

В 1960 г. Derbyshire (67а) показал АГ-родство между ВКЧС и ВД КРС. Для детального анализа АГ структуры вирусов используют монАТ (127,148). При тестировании других пестивирусов с помощью непрямой ИФ и ИФА было показано, что некоторые монАТ выявляли только цитопатогенный вариант ВД, тогда как другие широко реагировали со всемн изолятами ВД или с ВКЧС и ПБО (42, 58, 83, 136). Убиквитин обнаружен в геноме цитопатогенного штамма и не выявлен в геноме нецитопатогенного. Полагают, что рекомбинация вируса с клеточной РНК приводит к образованию геномов цитопатогенных ВД КРС (112). Представлена более точная и полная картина организации вирусного генома и строения его экспрессии (64). При изучении геномных разнообразий 28 цитопатогенных и 37 не цитопатогенных изолятов вируса диареи КРС с помощью зондов установлено, что геномы 15 изолятов отличались менее, чем на 15% от геномных фрагментов ВД urr.NADL. Геномы других изолятов отличались на 36-43% и еще 10 изолятов более, чем на 43% (135). Описано применение ПЦР для выявления ВКЧС и ВД КРС в культуре ткани (138а).

Антигенная вариабельность и родство. Различные штаммы ВД различаются по вирулентности, тропизму и цитопатогенному действию, но идентичны в АГ отношении.

По результатам PH и непрямой ИФ с монАТ референтные цитопатогенные и не цитопатогенные штаммы ВД-БС разделены на три группы: I - NADL-подобные, II - New York I- подобные, III - Oregon С24У-подобные. Полевые изоляты вируса были отнесены к I или II группе и не один из них не был отнесен к группе III. Однако по результатам PH большинство штаммов ВД обладает общим АГ, который несет основной эпитоп нейтрализации (115). Все изоляты ВД относятся к одной серологически родственной группе (95). Шт. Орегон С- 24V по антигенным свойствам отличался от других референтных шт. NADL и Нью-Йорк-1, которые явились прототипами полевых изолятов (10). Обнаружена тесная АГ связь ВД с вирусами КЧС (32) и ПБО вероятно за счет сходства АГ структуры гликозипированного полипептида 55кД (130).

Среди изолятов ВД КРС обнаружена вариабельность, в результате которой возможно заражение плодов вирусом диареи даже у вакцинированных коров-матерей. Все 13 изолятов ВД КРС в 4-х различных фермах Швеции, выделенных от КРС и овец, оказались сходными. Однако определенные эпитопы, присутствующие в изолятах, полученных от КРС, укорачивались при последующей передаче вируса овцам. Все изоляты были отнесены к ВД КРС. Обнаруженная у них специфичность для стада, но не для вида, показала, что ВД КРС легко передается между овцами и КРС (123а).

С помощью монАТ установлено значительное генетическое разнообразие популяций вируса. Использование зондов нуклеиновых кислот для диагностики затруднено обнаруженной у изолятов вируса вариацией нуклеотидной последовательности (79). Одновременно показано АГ-родство белков ВД КРС pi75, р80 и р125 (69). Современные данные о молекулярной биологии пестивируса, вызывающего ВД-БС КРС, изложены в монографии (46).

В 1973 г. Horzinek (91) предложил термин пестивирусы, чтобы сгруппировать 2 АГ родственных оболочечных РНК-содержащих вируса - возбудитель КЧС и ВД КРС. В 1982 г. Международный Комитет по таксономии вирусов принял эту номенклатуру и определил родовой статус для пестивирусов, включив их в семейство Togaviridae. Однако в настоящее время молекулярно-биологические данные подтверждают, что ВД КРС, в прошлом включенный в семейство Togaviridae, обоснованно перенесен во вновь образованное семейство Flaviviridae, которое ранее было родом (76).

Референтные штаммы. Известно следующие референс-штаммы ВД: Singer, Орегон C24V, NADL, New York. Фиигерпринтирование олигонуклеотидов позволяет эффективно различать референс-штаммы Singer, NADL, New York-1. Данный метод рекомендован для определения чистоты штаммов ВД КРС (99).

Получены вирусспецифические монАТ к ВД (120). Они используются для идентификации референс-штаммов вируса в PH и РДП с белком gp56.

Локализация вируса, вирусоносительство. У естественно восприимчивых больных животных вирус или вирусный АГ ВД-БС обнаруживали практически во всех органах: в клетках эпителия, лимфоцитах и макрофагах (118).

Вирусоносительство может быть продолжительным. В органах переболевших вирус может сохраняться до 200 дн, в респираторном тракте - до 56 , а в лимфоузлах кишечника - до 39 дн. Из крови переболевших телят его удавалось выделять в течение 4 мес.

Антигенная активность. Вирус обладает выраженной АГ-активностью. В крови переболевших животных обнаруживают ПА, ВНА и КСА. Наиболее выраженный гуморальный ответ наблюдали у телят на VP2 и VP3 ВД (77). Нейтрализующие монАТ к ВД связывают гликопротеином VP3 с мол.м. 56-58 кД (77а). Ракетным ИЭФ показано различие между IgG в сыворотке плодов и телят, что указывает на то, что АТ плода не материнского, а фетального происхождения, индуцированые вирусным АГ.

Экспериментальная инфекция. Результаты воспроизведения оказались различными. В некоторых случаях удавалось вызывать слабую интерстициальную пневмонию, в других слабое респираторное заболевание, сопровождающееся лейкемией (126). Заражение удается при внутривенном, интраназальном, внутрибрюшинном и подкожном введениях вируссодержащего материала, а также контактным путем на телятах 2-6-мес возраста.

Контакт “нос к носу” является эффектным путем экспериментального заражения (143). Температура повышается на 2, 4 и 7-й дни после заражения. При внутривенном заражении телят культуральным вирусом наблюдают повышение температуры, лейкопению, слизистые истечения из носовой полости и диарею на 4-7-й день. При внутривенном заражении телят 1-15-мес возраста цитопатогенным вирусом клинические признаки развивались через 5-7 дн.

При заражении стельных коров per os, внутривенно и внутримышечно на любой стадии беременности вирус проникает через плаценту в плод. Если заражение производится в 70- 90-дн периоде стельности, плод погибает в период с 90-го по 180-й день, у инфицированного плода поражаются роговица (слепота), ротовая полость и мозжечок. Инфицирование неиммунных стельных коров с 90-го дня стельности приводит к иммунизации плодов, но более ранняя трансплацентарная инфекция вирусом не сопровождается развитием иммунитета у плодов, и только с 4 мес происходит становление их иммунокомпетентности. Вследствие иммунной толерантности у ранних плодов возникает персистентная инфекция, которая может быть выявлена в постнатальном периоде. Иммунотолерантность является предпосылкой для цепи последующих иммунопатологических событий.

У экспериментально зараженных телят вирус обнаруживали в кишечнике, трахее, бронхиальных лимфоузлах и легких в течение 56, а в носовых секретах доЮЗ дн (12,13).

Заражение коров при случке может вызывать раннюю гибель плодов, рождение телят с поражениями глаз и нервной системы. У иммунных коров рождаются неинфицированные телята, у неиммунных - потомство почти всегда инфицировано. В большинстве случаев инфицирование плода происходит в первые 40 дн беременности и сопровождается гибелью эмбриона, его рассасыванием, мумификацией или абортом. Заражение плода на 40-120-м дне беременности приводит к рождению персистентно инфицированных телят без вирусспе- цифических АТ. В последнем случае телята не продуцируют АТ при одновременном и длительном выделении вируса в большом количестве.

Прн экспериментальном заражении супоросных свиней не отмечали клинических признаков болезни и повышения температуры тела. Однако развитие болезни было подтверждено выделением вируса из крови на 7-е сут после заражения, а также обнаружением специфических АТ через 21 день. Иногда экспериментальная инфекция у поросят протекает субклинически и проявляется слабой лихорадкой. Виремия подтверждена выделением виру са из носового секрета, фекалий, крови, мезентериальных лимфоузлов, селезенки. Вирус размножается в организме поросят 20-30-дн возраста. Вирус, выделенный от свиней, утрачивает способность вызывать цитопатические изменения в культуре клеток. Необходимо учитывать возможность носительства вируса свиньями, которые служат промежуточным хозяином, что способствует сохранению вируса в природе. При заражении ВД КРС свиноматок различной стадии супоросности рождались нормальные пометы поросят. Свиноматки передавали через молозиво АТ к ВД. Эти же пробы молозива содержали АТ к ВКЧС.

Вакцинный и полевой вирусы могут вызывать поражения ЦНС (атаксия, кривошеесть, астазия и опистотонус) у плода, если он инфицируется в период 3-4 мес. Заражение после 180-дн беременности не сопровождается выраженным поражением плода. Персистентная инфекция нецитопатогенным вирусом предрасполагает животных к развитию тяжелого клинического заболевания после заражения цитопатогенным вирусом. Иногда происходят мумификация плода, мертворождение, дефекты глаз, церебральные дефекты, недоразвитие нижней челюсти, деформация скелетных мышц и облысение. Иногда экспериментально зараженные животные переболевают бессимптомно. У зараженных животных вирус сравнительно легко удается выделить из крови.

Имеются сообщения о возможности экспериментального заражения овец, коз, поросят и кроликов. Белые мыши, крысы, морские свинки, собаки, кошки, цыплята, голуби устойчивы к заражению. Некоторые штаммы вызывают заболевание крольчат в возрасте до 1 мес (15, 17,19). У взрослых свиней инфекция протекает бессимптомно, а у поросят - с клиническими признаками, сходными с хронической КЧС (142). Доказана передача ВД от КРС овцам, и наоборот (54а). При экспериментальном заражении коз в различной стадии беременности, не содержащих ВНА к ВД, аборты и мертворождения составляли около 100% у всех инфицированных в первые 7-8 дн беременности (68).

Культивирование. Все известные штаммы вируса по цитопатогенной активности подразделяются на 2 группы (биотипа): цитопатогенные (Орегон С-24, NADL, ТМ-1, ТН-2, 61/1487 ST, C-60F и др.) и не цитопатогенные (New York, Indiana, С61220, SAN и др. (4, 6, 18, 19, 95). По характеру ЦПД штаммы 1-ого биотипа подразделяются на 2 подгруппы: штаммы, вызывающие ЦПД, сходные с эталонными шт. Орегон C-24V, и штаммы, вызывающие депрессию роста клеточного монослоя, подобно шт. NADL. ЦПД, вызываемое шт. Орегон C-24V, начинается через 16-48 ч (в зависимости от типа культуры клеток) и достигает максимума на 3-4-е сут после заражения (16, 17, 21). Оно проявляется мелкозернистой инфильтрацией в клетках фибробластного типа, вокуолизацией в перинуклеарной зоне. Сроки развития цитопатических изменений не соответствуют увеличению титра вируса. К 72-96 ч после инокуляции, когда титры вируса достигают максимума 105,5-106’5 ТЦД^о/мд в первичной культуре тестикул отмечают лишь начало ЦПД (17, 22). У цитопатогенных штаммов ВД 2-ой подгруппы (подобных NADL) характер ЦПД заключается в дегенерации, округлении и отслоении округлых клеток от стекла при отсутствии вакуолизации. Округлые клетки, уменьшенные в размере, собираются в группы произвольной конфигурации (18).

Многие авторы пытались адаптировать цитопатогенные штаммы к стабильным перевиваемым или диплоидным линиям клеток. Шт. NADL и Орегон C-24V были адаптированы в 1969 г. к диплоидной культуре почки свиньи (линии РК-12-15) (55), почки хомяка (линия НАК), человеческим клеткам ERK-1, клеткам носовых раковин (110), к перевиваемым линиям MDBK (Madin-Darby-Bovine-Kidney), ППЭК (2), почки овцы (20) и др. Показана высокая чувствительность диплоидного штамма эпителиальных клеток коронарных сосудов плода коровы к данному вирусу (8). Он также размножается в макрофагах и лимфоцитах, культивируемых in vitro (52). Перевиваемая линия культуры клеток MDBK оказались пригодной для накопления больших количеств вируса ВД-БС. Наибольшей чувствительностью, как при изоляции, так и культивировании оказалась перевиваемая линия клеток коронарных

сосудов теленка (КСТ) (14). Она более чувствительна по сравнению с первичной культурой тестикул бычка (ТБ). Вирус, репродуцированный в перевиваемых клетках КСТ, обладал большей АГ активностью по сравнению с эталонным шт. Орегон С24-У. Использование указанного изолята и вируса ИРТ на чувствительных перевиваемых клетках КСТ (для ВД- БС) и МОВК (для вируса ИРГ) позволило Г.Халеневу и др. (23) изготовить активную ассоциированную инактивированную вакцину против 2-х инфекций.

Установлена возможность выращивания вакцинного шт. ВК1-В1 ВД КРС в суспензионной культуре клеток ВНК-21 и определены оптимальные условия его культивирования (8а). На КЭ культивируются далеко не все штаммы вируса. Лишь отдельные из них (например шт. Вирджиния) после нескольких пассажей через желточный мешок удалось адаптировать к этой системе. Размножение таких штаммов в желточном мешке происходило к 48 ч после инокуляции, и обычно на 3-6-е сут после заражения около 50% эмбрионов погибали. При гистологическом исследовании пораженной мембраны находили зернистые или вакуолизированные клетки.

Гемагглютинирующие и гемадсорбирующие свойства не установлены.