ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ

ВБА состоит из одетого нуклеокапсида, который окружает линейный геном из ДНК мол.м. 145 кД. Геном вируса составляет 30-кратный размер самого маленького известного ДНК-содержащего патогена свиней (например, парвовируса свиней) и является настолько большим, чтобы быть достаточным для кодирования около 100 протеинов. Размер вириона 150-180 нм в диаметре, нуклеокапсида 105-110 нм. Нуклеокапсид состоит по крайней мере из 8 белков от 22,5 до 142 кД. Белки с мол.м. 142, 34 и 32 кД являются преобладающими (103а). Вирусная оболочка имеет из 9 структурных белков с мол.м. от 50 до 130 кД (54, 107). Восемь из них имеют сахар, прикрепленный к ним, и относятся к гликопротеинам. Эти гликопротеины включают gl, gll, которые являются комплексом протеинов - Ila, lib, Пс; gill, gl V, gp50 и gp63. Оставшийся протеин негликозилирован и имеет мол.м. 115 кД. Другие важные белки, которые кодируются вирусным геномом, включают gX и тимидинкиназу (ТК). Гены, которые кодируют главные из вышеперечисленных белков, не являются необходимыми для вирусной репликации. Например, вакцинный шт. ВБА, созданный генно- инженерным путем дефицитен по одному или нескольким белкам gl, gin, gX и ТК.

Роль, которую играют индивидуальные вирусные белки в вирулентности и индукции иммунного ответа, частично охарактеризована. Вирулентность ВБА контролируется генами, кодирующими гликопротеинами gl, gill, gp63 и ТК (107), gll, gill и gp50 являются самыми главньми в отношении индукции иммунитета. Это заключение основывается на наблюдении, что монАТ, которые представляют множественные эпитопы gll, нейтрализуют ВБА in vitro, а также активируют антителозависимую клеточно-медиаторную цитотоксичность. Специфичные gll монАТ также сравнивали с протективным иммунитетом у мышей, которых экспериментально заражали ВБА. МонАТ к gill также нейтрализуют ВБА in vitro и обеспечивают иммунитет у мышей и свиней. Протективный иммунитет обеспечивается у мышей и свиней, которым вводили gpSO-специфичные монАТ (79) или иммунизировали ре- комбинантно полученными gp50 и gp63 (48, 49, 71, 78).

Устойчивость. Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, быстро инактивируется желчью, устойчив к широким колебаниям pH (5-9), 1-2%-ный раствор формальдегида инактивирует вирус в течение 15-20 мин. Он устойчив к прогреванию, сохраняет активность при 60°С 40-50 мин, инактивируется через 3 мин при 80°С. Однако замораживание при -20°С способствует его инактивации. Прямые солнечные лучи обезвреживают его в течение 6 ч, рассеянные солнечные лучи - за 12-48 ч, ультрафиолетовые - за 1 мин. Холод консервирует вирус, при 1-4°С он активен от 130 дн до 4 лет. В 40%-ном растворе глицерина и глицерин- фосфатном буфере с нейтральным pH сохраняется в течение 2-3 лет, в насыщенном растворе NaCl - не менее 3 мес. В тканях высохших трупов грызунов вирус сохраняется до 6 мес, в гниющих трупах - до 1 мес. В моче летом вирус сохраняет активность 3 нед и 8-15 нед в зимнее время, в навозной жиже - летом в течение 1 мес, зимой - около 3 мес. При биотер- мическом обеззараживании навоза инактивируется в течение 8-15 дн. Горячий 3%-ный раствор NaOH, 20%-ная взвесь свежегашеной извести, 1%-ный раствор формальдегида убивают вирус за 5-20 мин, однако растворы креолина и карболовой кислоты слабоэффективны.

Антигенная структура. В оболочке ВБА различают 3 основных гликопротеина: Д1, Д2, ДЗ, кодируемых U-сегментом вирусного генома. При инъекции свиньям АТ формируются ко всем гликопротеинам. Гликопротеин Д1 состоит из 2 субъединиц с мол.м. около 80 кД - концевой фрагмент Д1 содержит высокоантигенный домен, способный вызывать образование ВНА и защитный эффект. Гликопротеины Д2 и ДЗ имеют соответственно мол.м. 110 и 60 кД (22). Эпитопное картирование вирусных АГ и изучение роли отдельных эпитопов в индукции иммунного ответа имеет важное значение при разработке маркированной вакцины и дискриминирующей диагностической тест-системы. Гликопротеин gl ВБА служит маркерньм белком в вакцинах и соответствующих тест-системах. При использовании 13 монАТ к gl ВБА все они реагировали с gl-позитивными штаммами (К, Арский, ВГНКИ, БУК, Ка) в ИФА и в методе иммунопероксидазного окрашивания бляшек, но не реагировали с gl-негативными штаммами (Bartha, N1A-4). Установлено по крайней мере 8 эпитопов gl и выявлено их взаимное расположение. В дальнейшем возможно выявление иммунодо- минантных консервативных эпитопов для создания новых отечественных маркированных вакцин и дискриминирующих тест-систем (20а). АГ активность. Вирус продуцирует образование ВНА, КСА и ПА, которые можно обнаружить с помощью PH, РСК и РДП. Специфические КСА появляются в сыворотке крови через 3 дн после заражения, и титр их не снижается в течение 30-40 дн. ВНА появляются на 5-7 дн, достигают максимума через 3-4 нед и титр их сохраняется от 1 г. до 1,5 лет.

Вирусные гликопротеины Д1, ДЗ и gp50 индуцируют развитие ВН активности сывороточных АТ. Вакцинированные свиньи и животные-рековалесценты, с титром ВНА 1-80 и выше, противостоят экспериментальному заражению. Динамика АТ в период с 5-го по 27 день после заражения 6-нед поросят характеризовалась следующими показателями. На 5-7- е сут после заражения появлялись преимуществнно АТ класса М, которые обнаруживали только в РНГА. ВНА начинали появляться только с 12-го дня. Таким образом, РНГА -более чувствительный метод диагностики инфекции, особенно на ранних сроках при наличии АТ класса М (56). ТК вируса и его гликопротеины важны для персистенции вируса в макрофагах и клетках нервной системы.

АГ вариабельность и родство. АГ вариантов у ВБА не установлено. Методом перекрестной ИФ установлено АГ родство ВБА и простого герпеса. Последовательности нуклеотидов ВБА гомологичны геному гликопротеинов дВ, дС, дД и дЕ вируса простого герпеса Изоляты вируса, выделенные в различных географических зонах США, существенно отличаются по АГ свойствам гликопротеинов, особенно Д1 и ДЗ. Наибольшее значение для разработки эффективных субъединичных вакцин имеет гликопротеин ДЗ. При отсутствии АГ вариантов ВБА различия между некоторыми штаммами все же были показаны с использованием монАТ. Штаммы ВБА могут быть дифференцированы с высокой степенью достоверности по биологическим и физическим маркерам. Вакцинные, как и полевые штаммы, могут быть дифференцированы с использованием маркеров температуро- и трипсининакти- вации в комбинации с маркерами вирулентности для мышей и кроликов. Геномные различия, показанные рестрикционным эндонуклеазным анализом также могут использоваться для подтверждения различия штаммов ВБА. Большинство генетических характеристик штаммов стабилизируются после нескольких пассажей на поросятах, что играет определенную роль в эпизоотологических исследованиях (10-16,80,84).

Предложен метод дифференциации разных штаммов ВБА, основанный на разделении рестриктазных фрагментов ДНК. Полученные фрагменты разделяют электрофорезом или гели окрашивают серебром. Данный метод позволяет достаточно четко идентифицировать штаммы ВБА по подвижности полученных фрагментов (47, 62, 95). Известны аттенуированные шт. Bartha БА, БУК-ТК/650А, МК-25, В-КА68 и вирулентный шт. NIA. С помощью рестрикционного анализа показано, что каждый из этих шт. имеет свой характерный фрагментарный профиль и по этому признаку каждый из них может быть легко дифференцирован от других вакцинных и вирулентных штаммов. Учитываются признаки: вирулентость штаммов для мышей (М), способность индуцировать образование ТК в инфицированных клетках, фрагментарный профиль вирусной ДНК (93, 96). Между тем имеется сообщение об отсутсвии корреляции между вирулентностью шт. и их изоэлектрическими точками (112).

Локализация и выделение вируса. Вирус пантропен и может быть обнаружен у естественно восприимчивых животных в верхних дыхательных путях, легких и через 48 ч в головном мозге, селезенке, печени, почках, слюнных железах, миндалинах, коже, лимфоузлах. У свиней его можно обнаружить на 1-6-й день болезни в носовой слизи. На 8-й день вирус исчезает из ЦНС, в это время в крови появляются ВНА. Первично вирус попадает в носоглотку, откуда его можно выделять в течение 2-х нед, а затем распространяется прямым нейролимфогенным путем по обонятельному, тройничному и языкоглоточному нервам, достигая ЦНС. При проникновении через кожу вирус быстро размножается в месте внедрения в жировой, соединительной, мышечной тканях и затем лимфогенным и гематогенным путями распространяется по всему организму, обнаруживаясь во всех внутренних органах. Из организма вирус экскретируется с носовыми истечениями и слюной, но может присутствовать и в эякуляте. В крови его обычно можно обнаружить лишь в начале болезни, вирусемия крат ковременна. В миндалинах естественно переболевших и экспериментально зараженных подсвинков вирус находится 120 дн, выделение его продолжается не меиее 60 дн (до 18 мес)после инфицирования (24, 25). Вакцинация не прекращает репродукцию вирулентного вируса, который обнаружен в миндалинах всех животных, убитых на 3-6-й день, и в мозге большинства свиней. При подкожной вакцинации свиней шт. БУК он регулярно в течение 2- 8 дн выявляется в подкожной клетчатке на месте введения, в региональных лимфоузлах и в 18% случаев в ЦНС. Также распределяется вирус вакцинного шт. ТК-200.

Кроме указанных органов его часто обнаруживают в надпочечниках. Доказана возможность проникновения в плоды вирулентного и вакцинного штаммов вируса через плаценту. У павших поросят наивысшая концентрация вируса обнаружена в миндалинах, лимфоузлах области головы и легких. Описано невральное распространение вируса у телят, после смерти которых его обнаруживали в ЦНС. У кроликов и свиней он распространяется по кровеносным сосудам (24, 25). Инфицированные свиньи выделяют ВБА на 24 ч раньше проявления клинических признаков. Свиньи с титром ВНА 3,0-4,5 log2, вакцинированные интрана- зально, также выделяют во внешнюю среду возбудитель, но в значительно меньших количествах.

Персистенция вируса. Доказана реактивация in vivo и in vitro латентного вируса у поросят от вакцинированных свиноматок. В первичной культуре клеток почки свиньи, зараженной шт. БУК и АБ, удавалось получить латентную инфекцию, шт. АБ персистировал в инфицированной культуре клеток в течение 193 дн. Переболевшие бессимптомно серые крысы и мыши остаются вирусоносителями 130-140 дн. Длительность вирусоносительства у свиней колеблется в зависимости от возраста переболевших животных: у свиноматок и хряков - свыше 180 дн, у подсвинков моложе 6 мес - более 130 дн, и даже считают, что у выздоровевших свиней БА переходит в латентную форму, при которой вирус может пожизненно персистировать в ЦНС, миндалинах и лимфоузлах, и животные также могут быть источником инфекции. Поэтому трудности искоренения болезни связаны с тем, что выздоровевшие животные остаются носителями вируса и могут его выделять после стрессовых воздействий. Поскольку вирусоносительство при БА широко распространено, то для исключения его необходимо обязательно исследовать сыворотки крови в PH от всех вновь поступающих в хозяйство животных (21,25).

Аттенуированные, имеющие генную делецию мутанты ВБА были исследованы на способность вызывать реактивированную латентную реакцию у свиней. Вирусы ( обозначенные

А, В и С) были выделены из трех коммерческих вакцин, разрешенных к использованию в США. Вирусы А и С были сходны в том, что имели генно-инженерные делеции генов для ТК и гликопротеина X (gx). Однако они были изготовлены из генетически различных родительских штаммов. Каждым вирусом инфицировали ора-назально по 4 свиньи, и 10 нед спустя все они получили дексаметазон. Все вирусы реплицировались, что подтверждалось изоляцией их из носовых мазков и наличием иммунного ответа. Реактивация вируса в дальнейшем была индуцирована дексаметазоном у 2-х из 4-х свиней, зараженных ВБА. Однако реактивированный вирус был сходным, но не идентичным ВБА, использованному для установления латентной инфекции. Таким образом, результаты показали, что аттенуированный ТК-негативный вирус может обусловливать реактивированную латентную инфекцию у свиней (44, 60, 83, 99). В 1960 г. в Польше были отмечены многочисленные спорадические случаи и вспышки БА среди КРС. Источником заражения служили больные или латентно инфицированные свиньи. Однако как больные, так и здоровые животные оставались серо- негативными (101).

Рестрикционный эндонуклеазный анализ (Bam Н1) генома вируса, реактивированного и выделенного от латентно инфицированных свиней, показал, что состояние вирусного генома при становлении и поддержании латентной фазы не связано со структурным изменением вирусной ДНК (50, 51). О широте распространения латентной инфекции БА можно судить хотя бы по тому, что 50% поголовья свиней Северной Ирландии инфицированы вирусом, хотя признаки болезни наблюдаются редко (59).

Молекулярные основы патогенности. Молекулярные основы патогенности оболочеч- ных ДНК-содержащих вирусов изучены недостаточно. Установлено, что вакцинный шт. Барта имеет делецию в Gc-участке генома (ед. карты 0,855-0,882), который кодирует гликопротеины gpl и gp63 (85). Восстановление в геноме шт. Барта интактной области при помощи Gc-участка нз дикого вируса псевдобешенства (новый шт. Барта 43/25а) приводит к усилению способности вируса выходить из зараженных клеток почки кролика и формировать большие бляшки. Рекомбинацию аттенуированных штаммов ВБА отмечали в организме вакцинированных животных с возникновением новых вирулентных штаммов вируса, представляющих практическую опасность (96, 67а).

Методом рестрикционного анализа ДНК полевых изолятов и вакцинных шт. ВБА установлена генетическая гетерогенность: изменения в подвижности фрагментов и получение фрагментов разных размеров в результате утраты или приобретения сайтов расщепления рестрикционной эндонуклеазой (50). Обнаружен новый вирулентный гликопротеин, детерминирующий фактор вирулентности ВБА (85). Помимо того, известно, что гликопротеин III (ДЗ) ВБА связывается с 3-им компонентом копмлемента свиней. Специфичность вирусного белка в отношении комплемента С3 свиней коррелирует с тропизмом ВБА по отношению к хозяину. Полагают, что взаимодействие вируса с комплементом Сз свиней может быть фактором вирулентности ВБА (60). В США заболевают БА не только молодняк но и взрослые свиньи, что объясняют повышением вирулентности местных шт. вируса.

Экспериментальная инфекция. При интраназальном заражении гибель молодых супоросных свиноматок составляет около 40% . Кроме свиней, кроликов, норок, кошек болезнь можно легко воспроизвести на крысах при заражении их подкожно или интраназально. Лабораторные крысы более чувствительны, чем дикие. Заболевшие животные погибают; у крыс-реконвалесцентов АТ не обнаруживают. Здоровые крысы, находившиеся в одной клетке с больными крысами или свиньями, как правило, не заболевают, и АТ у них нет. Эго наблюдение дало основание отрицать возможную роль крыс в переносе и резервации инфекции. Мыши в 1 мес возрасте чувствительны к ВБА прн внутримозговом и подкожном заражениях. Кортизон повышает их чувствительность. Цыплята 1 сут возраста восприимчивы к вирусу при различных способах заражения. Однако с возрастом смертность зараженных снижается. У больных кроликов с яркой клинической картиной расчесов через 41-75 ч после заражения (Рис. 91), установлено размножение вируса в ядрах ганглиозных, оболо- чечных, реже шванновских и эндотелиальных клеток капилляров (24).

Заражение всех чувствительных животных смертельно, хотя имеется одно сообщение, которое подтверждает выздоровление зараженной коровы. Некоторые дикие животные также чувствительны к ВБА со смертельным исходом - это опоссумы, еноты, крысы, мыши; практически все животные, окружающие свиноферму. Из приматов чувствительны обезья- ны- резусы и мармозетки, устойчивы шимпанзе и Barbary. Сообщения о заражении людей ограничены н недостаточно документированы - не основывались на выделении вируса. В 1987 г. сообщалось о трех больных в Дании и Франции, у которых развивалась низкого уровня сероконверсия к ВБА после заболевания, которое возможно было передано от кошек. Возможно, что в данном случае имела место перекрестная реакция с АТ, индуцированными другими герпесвирусами (69а).

Заражение вирулентным ВБА вакцинированных серонегативных свиноматок приводит к снижению их репродуктивности, трансплацентарной передаче вируса плодам и персистенции вируса у полученных от них поросят (22).

Культивирование. ВБА пассируется на кроликах, белых мышах (предварительно обработанных гидрокортизоном), в первичных культурах клеток КЭ, почек КРС, обезьян, ягнят, свиней, перевиваемых клетках HeLa, КЭМ-Ла, L, ПЭС, СОЦ, Нер, Ят-82, ППК-666, ППК-Д, ФЛ, ПЭКр, ПСГК, ПСГК-60 и др., вызывая образование некротических фокусов - бляшек, число которых пропорционально титру вируса (6а). Клетки КЭМ-Ла неодинаково чувствительны к различным шт. ВБА, а фибробласты КЭ более чуствительны, чем первичная культура клеток мышиного эмбриона. В культуре ФКЭ вирус образует бляшки с агаровым покрытием через 48 ч после заражения. Помимо культур клеток, вирус удается культивировать в КЭ при инокуляции на ХАО после некоторого периода адаптации альтернативными пассажами. На ХАО наблюдаются специфические фокусы поражения и генерализованная инфекция. Эмбрионы гибнут через 24-96 ч (в зависимости от степени адаптации).

Все выделенные штаммы ВБА вызывают идентичные морфологические изменения клеток, кроме клеток КЭ, где не всегда можно обнаружить синтиций и тельца-включения. Вирус вызывает округление отдельных клеток и образование гигантских клеток (с 2-10 ядрами). Способность образовывать симпласты - это генетический признак вируса, фенотипически проявляется он только в определенных условиях. Установлена связь между ЦПД, морфологией бляшек и вирулентностью штамма. Штаммы, высоковирулентиые для свиней и КРС, обладают способностью вызывать образование синцития в культуре клеток. За слияние вирусной и клеточной оболочек и проникновение вируса в клетку ответственен gll. Прикрепление вируса к клеткам in vitro опосредовано его главными гликопротеинами, которые в этом отношении можно расположить в ряду gill >gI>gIV (22). При получении инактивированных вакцин вирус выращивают в 1слойных и суспензионных культурах различного происхождения. Суспензионные культуры постоянных линий клеток оказались весьма продуктивными для промышленного получения вирусного сырья. Вирус в этих системах накапливался в титре 10 8-10 9ТЦ Д5о (22).

Синтез ДНК ВБА делится на 2 фазы: раннюю, которая инициируется через 2 ч 20 мин после заражения и заканчивается к 3 ч, и позднюю, которая инициируется через 3 ч после заражения. В течение ранней фазы ДНК вируса локализовано по периферии ядра около ядерной мембраны, тогда как в позднюю - в центральной части ядра. В раннюю фазу не более 12% ДНК связано с ядерным матриксом, тогда как в позднюю - 40%. С ядерным матриксом связаны, в основном, 2 белка: основной ДНК-связывающий белок 136К и 23 К. Ядерный матрикс содержит нормальное количество клеточных белков 63К - 45К (29). ЦПЭ аттенуированных вариантов обусловлен длиной генома маркера вирулентности. У мутантов он располагается как в короткой (US) так и в длинной (UL) уникальных областях генома. Делеция в короткой уникальной области, как правило, ведет к снижению вирулентности для свиней и защищает их при последующем заражении патогенным штаммом вируса (96Ь).

ГА свойства. Показано, что гемагглютинин ВБА легко сорбируется на мышиных эритроцитах при температуре 4, 22 и 37°С. Но не сорбируется на эритроцитах КРС. При этом связавшийся с эритроцитами ГА не элюируется с них в присутствии нейраминидазы. Специфичные для ГА рецепторы мышиных эритроцитов инактивируются трипсином, осам илазой, пепсином, КЮ4и ЭДТА, но не папаином, р-глюкозидазой, фосфолипазой С, нейраминидазой, этиловым эфиром, хлороформом и др., что указывает на гликопротеидную природу активного компонента ГА. ГА стабилен при 37°С, разрушается при 60°С. При зональном центрифугировании вирусных препаратов в градиенте плотности сахарозы пик Г А активности совпадает с пиком инфекционности (67). ГА - активность ВБА КРС связана с мажорным g97, расположенным в шипиках вириона. Главные нейтрализующие эпитопы расположены на ГА домене, что свидетельствует о перспективности использования ГА - антигена ВБА КРС для изготовления субъединичной вакцины. ВБА кошек агглютинирует эритроциты мышей, хотя Г А домены этих вирусов неидентичны (22).