ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭСТРАДИОЛА В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC AUTOMATION INC., США)  

Несвязанный конъюгат меченого эстрадиола отмывают из ячеек, добавляют хромогенный раствор и после развития голубой окраски добавляют стоп-раствор для остановки цветной реакции. Считывание результатов проводят на ридере при длине волны 450 нм.

Реактивы: 96 микротитрационных ячеек, покрытых козьими антикроличьими IgG;

референс-стандарты эстрадиола, готовые к использованию —

6. флаконов по 0,5 мл с концентрациями 0,0, 10,0, 30,0, 100,0, 300,0 и 1000,0 пг/мл;

кроличий антиэстрадиоловый реагент (розового цвета) — 1 флакон (7 мл);

конъюгат эстрадиола и ПХ (голубого цвета) — 1 флакон (12 мл);

эстрадиоловые контроли — 2 флакона по 0,5 мл с уровнями I и

2. Готовые к использованию;

ТМБ-реагент — 1 флакон (11 мл);

стоп-раствор (кислота хлористоводородная) — 1 флакон (11 мл);

деионизированная или бидистиллированная вода.

Примечание. Все реагенты и пробы перед исследованием следует привести к комнатной температуре (25 °С) и

тщательно перемешать.

Оборудование: микроплашечный иммуноферментный анализатор (ридер); автоматическое промывающее устройство; полуавтоматические пипетки на 25, 50, 100, 200 мкл и 1,0 мл; фильтровальная бумага или бумажные салфетки для просушивания стрипов; миллиметровая бумага.

Подготовка реагентов к анализу. Перед использованием все реагенты и пробы необходимо привести к комнатной температуре (18—25 °С). Сыворотки, в которых ожидается концентрация эстра- диола свыше 1000 пг/мл, следует предварительно развести разбавителем сыворотки.

Ход определения. Закрепляют в штативе необходимое количество ячеек. Вносят по 25 мкл стандартов, контролей и исследуемых проб (в параллелях) в соответствующие ячейки. Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл конъюгата эстрадиола-ПХ и по 50 мкл кроличьего анти-эстрадиолового реагента. Тщательно и аккуратно перемешивают в течение 30 с. Инкубируют при комнатной температуре (18—25 °С) на протяжении 90 мин. При помощи автоматического промывающего устройства исследуемые ячейки пятикратно промывают бидистиллированной водой. Остатки жидкости в ячейках удаляют, переворачивая и постукивая плашкой по фильтровальной бумаге. Вносят в каждую ячейку по 100 мкл ТМБ-хро- могенного раствора, осторожно перемешивают в течение 5 с. Инкубируют при комнатной температуре (18—25 °С) 20 мин. Добавляют по 100 мкл стоп-раствора (кислоты хлористоводородной) в каждую ячейку. Осторожно перемешивают 30 с. Очень важно, чтобы голубая окраска полностью перешла в желтую. Считывают абсорбцию на ридере при длине волны 450 нм в течение 15 мин.

По полученным результатам стандартов строят калибровочную кривую и по ней определяют концентрацию гормона в исследуемых пробах сыворотки.

Клиническое значение. Эстрадиол — естественный эстроген, секретируемый преимущественно яичниками и в незначительных количествах корой надпочечников, у беременных плацентой, у самцов семенниками. Эстрадиол обеспечивает развитие, диф- ференцировку и функциональную активность органов размножения самок, стимулирует рост и развитие фолликулов, повышает чувствительность яичников к действию гонадотропинов. Он ускоряет рассасывание желтых тел и наступление очередного полового цик

ла. Под влиянием эстрадиола активируется влияние окситоцина на мышцы матки, повышается их сократительная функция, слегка открывается канал шейки матки во время половой охоты.

Количество эстрадиола в сыворотке (плазме) крови зависит от физиологического состояния животных. В период половой охоты коров оно колеблется в пределах 15—25 пг/мл (В. С. Шипилов с соавт., 1987) и доминирует над уровнем прогестерона, на 7-м месяце стельности — 209,2 ± 11,6; на 8-м — 232,3 + 8,2 пмоль/л (Г. А. Черемисинов с соавт., 1990). Максимальный уровень эстрадиола наблюдался за 2—3 нед до родов, в период родов и в начале стадии полового возбуждения (А. Г. Нежданов с соавт., 1986). По данным Г. Г. Харуты (1999), содержание эстрадиола в сыворотке крови за 60—45 дней до отела можно использовать для прогнозирования течения родов: при физиологическом течении оно составляет 2,26 ± 0,13 нмоль/л, а при последующей субинволюции — 1,37 ± 0,38 нмоль/л.

У кобыл в начале половой охоты количество 17(3-эстрадиола составляет 42,05 ± 5,94 пг/мл, через 12 ч после овуляции — 23,61 ± 3,14, через 2 дня после окончания стадии полового возбуждения содержание гормона уменьшается до 13,26 ± 2,34 пг/мл, на 6—8-й день оно составляло 10,75 ± 2,97, на 11—14-й день полового цикла — 26,7 ± 3,18; на 17—18-й день — 16,0 ± 1,59 пг/мл (Д. В. Подвалюк, 1997). В первые 3 мес жеребности количество эстрадиола составляет 46,1 ± 10,37 пг/мл; на 5—11-й месяц — уменьшается с 44,46 ± 7,11 до 16,6 ± 3,08 пг/мл, в период родов содержание эстрадиола составляет 17,0 ± 5,93 пг/мл (Д. В. Подвалюк, 1997).

Изложенные методы иммуноферментного определения гормонов апробируют В. В. Сахнюк, О. К. Голуб в Белоцерковском государственном аграрном университете под руководством академика УААН В. И. Левченко.

Условия подготовки образцов крови к определению гормонов изложены в справочном пособии «Обеспечение качества лабораторных исследований. Преаналитический этап». (М.: Юнимед-пресс, 2003. - С. 206-246).