ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОРТИЗОЛА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  

Реактивы: 96 микротитрационных ячеек (12 стрипов), внутренние стенки которых покрыты козьей антикроличьей глобулино- вой сывороткой;

кортизол-антисыворотка (голубая) — 1 флакон (11 мл) содержит кроличью антикортизоловую сыворотку в протеиновом (BSA) буфере с нертутным консервантом;

кортизол-стандарты — 1 флакон (0,5 мл), обозначенный А, содержит 0 мкг/дл кортизола; 7 флаконов (по 0,5 мл каждый), обозначенные В—Н, содержат кортизол в протеиновом буфере (BSA) с нертутным консервантом в концентрациях 0,5, 1,5, 4,0, 10,0, 20,0,

0. и 60 мкг/дл;

кортизол-контроли — 2 флакона (по 0,5 мл каждый) с уровнями I и II содержат кортизол низкой и высокой концентрации в протеиновом буфере сыворотки с нертутным консервантом;

кортизол-энзимный конъюгатный концентрат — 1 ампула (0,3 мл) содержит раствор кортизола в протеиновом буфере с нертутным консервантом.

конъюгатный растворитель — 1 флакон (11 мл) содержит основанный на протеине буфер с нертутным консервантом;

ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон (11 мл) содержит раствор тетраметилбензидина (ТМБ) в цитратном буфере с водорода пероксидом;

моющий концентрат — 1 флакон (100 мл) содержит буферные соли с неионным детергентом. Перед использованием разводят в 10 объемах деионизированной или бидистиллированной воды;

стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 М раствор серной кислоты;

бидистиллированная вода.

Примечание.

Оборудование: микропланшетный иммуноферментный анализатор Йа1 Рах-2100, настраиваемый на длину волны 450 нм и 600 или 620 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) Б1а1 Рах-2200, настраиваемый на 500—700 движений в 1 мин; автоматическое промывающее устройство Б1а1 Рах-2600; полуавтоматические дозаторы на 5—50, 50—200 и 200—1000 мкл, наконечники; градуированная лабораторная посуда; фильтровальная бумага для просушивания стрипов; миллиметровая бумага для построения калибровочного графика (при отсутствии программного обеспечения).

Подготовка реагентов к анализу. 1. Энзимный конъюгатный раствор: кортизол-энзимный конъюгатный концентрат развести в чистой посуде конъюгатным растворителем в соотношении 1:50 соответственно количеству используемых ячеек. Если используется вся плашка, необходимо отмерить точно 200 мкл кортизол-эн- зимного конъюгатного концентрата и 10 мл конъюгатного растворителя. Готовят непосредственно перед использованием.

2. Моющий раствор: 100 мл концентрата моющего раствора в колбе растворить в 900 мл бидистиллированной воды.
3. Микротитрационные ячейки: отобрать для исследования необходимое количество стрипов с ячейками. Остальные стрипы поместить в защитный влагонепроницаемый пакет с десикантом.

Ход определения. В используемые ячейки микропланшета дозатором вносят по 25 мкл стандартов, контролей и сыворотки крови. Добавляют по 100 мкл свежеприготовленного энзимного конъюгатного раствора. Осторожно встряхивают штатив с ячейками 5—10 с, перемешивая содержимое ячеек. Дозатором (лучше многоканальным) вносят в каждую ячейку по 100 мкл кортизол-антисыворотки.

Измеряют оптическую плотность раствора в ячейках при длине волны 450 и 620 нм (в течение 30 мин после добавления стоп-раствора).

Перед считыванием абсорбции необходимо установить прибор на «0» соответственно с нулевым стандартом (Blank).

Полученные значения стандартов кортизола используют для построения стандартной кривой, по которой определяют концентрацию гормона в исследуемых образцах. Пробы, значения которых превышают наивысший стандарт, необходимо дополнительно развести стандартом 0 мкг/дл и повторно исследовать.

Примечание. Все стандарты приведены в мкг/дл. Для перевода в нмоль/л необходимо мкг/дл • 27,6 = нмоль/л.

Клиническое значение. Кортизол вырабатывается корой надпочечников из холестерола. Стимулируется секреция кортизола адренокортикотропным гормоном гипофиза (АКТГ), выделение которого, в свою очередь, активируется гипоталамическим корти- котропным рилизинг-гормоном (КРГ, кортиколиберином). Секреция кортиколиберина контролируется соответствующими центрами головного мозга. Около 90 % циркулирующего в крови кортизола находится в связанном с глобулином состоянии, остальное количество — в свободном.

Кортизол усиливает синтез белка, в печени стимулирует синтез глюкозы из неуглеводистых источников, прежде всего — из аминокислот (глюконеогенез).

При первичной недостаточности коры надпочечников уменьшается синтез глюко- и минералокортикоидов (кортизола и альдостеро- на), при вторичной, обусловленной снижением секреции АКТГ, — глюкокортикоидов.

Гиперфункция коры надпочечников сопровождается увеличением синтеза кортизола и вызывает развитие синдрома Кушинга. Заболевание встречается у собак, чаще у самок среднего возраста. Выраженную генетическую предрасположенность к болезни имеют собаки пород боксер и пудель. В 80—85 % случаев гиперкортицизм у собак развивается вследствие поражения гипофиза (аденома или гипертрофия).

При первичной недостаточности коры надпочечников уровень кортизола уменьшается, а содержание АКТГ по принципу обратной связи — увеличивается (у собак — больше 50 нмоль/л). Диагностика синдрома Кушинга, вызванного аденомой гипофиза, основана на увеличении уровня АКТГ в сыворотке (плазме) крови.

При опухолях коры надпочечников синтез кортизола увеличен, а АКТГ — уменьшен.

В плазме крови бычков черно-пестрой породы 13—14-месячного возраста, по данным В. П. Радченко (1980), содержится 2,1—4,0 мкг/100 мл кортизола (58,0—110 нмоль/л), у коров на 7—8-м месяцах стельности — 9,8—17,4 нг/мл (Черемисинов с соавт., 1990), за 60—45 дней до отела — 2,9—40,3 (14,1 ± 1,66) нмоль/л, в период половой охоты — 13,3—23,2 нмоль/л (Г. Г. Харута, 1999).