ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНСУЛИНА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  

Реактивы: 96 полистириновых микротитрационных ячеек (плашка), на внутренние стенки которых нанесены антиинсулиновые антитела;

стандарты инсулина (лиофилизированные) — 1 флакон (обозначенный А) содержит 0 мкМЕ/мл; 5 флаконов (обозначенных В—F), содержат растворы с концентрациями соответственно 3,0,

0. 30,0, 100,0 и 300,0 мкМЕ/мл инсулина в человеческой сыворотке с нертутным консервантом. Стандарты А—Е используют при регулярных исследованиях (динамический ряд 3—100 мкМЕ/мл), а стандарты А, С—F — при исследованиях широкого диапазона (10—300 мкМЕ/мл);

контроли инсулина (лиофилизированные) — 2 флакона. Уровни I и II. Содержат высокую и низкую концентрации инсулина в человеческой сыворотке с нертутным консервантом;

инсулиновый антител-энзимный конъюгатный концентрат — 1 флакон содержит 0,3 мл раствора инсулина, конъюгированного с пероксидазой хрена в буфере с нертутным консервантом. Перед использованием растворяют в аналитическом буфере;

аналитический буфер (зеленый) — 1 флакон (28 мл) содержит протеиновый буфер с нертутным консервантом;

ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон (11 мл) содержит тетра- метилбензидин в цитратном буфере с пероксидом водорода;

концентрат моющего раствора — 1 флакон (60 мл) содержит солевой раствор с неионным детергентом;

стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 М раствор серной кислоты;

Примечание.

Оборудование: микропланшетныйиммуноферментныйанализатор 81а1 Рах-2100, настраиваемый на длину волны 450 нм, 600 или 620 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) 81а1 Рах-2200, настраиваемый на 500—700 движений в 1 мин; автоматическое промывающее устройство 81а1 Рах-2600; полуавтоматические дозаторы объемом 5—50, 50—200 и 200—1000 мкл, наконечники; градуированная лабораторная посуда, полистириновые пробирки; фильтровальная бумага для просушивания стрипов; миллиметровая бумага для построения калибровочного графика (при отсутствии программного обеспечения).

Подготовка реагентов к анализу. 1. Антител-энзимный конъюгатный раствор: в чистой посуде развести инсулиновый анти- тел-энзимный конъюгатный концентрат в аналитическом буфере (1 : 50), исходя из числа используемых ячеек. Если будет использована вся плашка, необходимо 200 мкл антител-энзимного конъюгатного концентрата инсулина растворить в 10 мл аналитического буфера. Разводить непосредственно перед использованием.

2. Стандарт А восстановленный (0 мкМЕ/мл): во флакон А добавить 1 мл бидистиллированной воды. Хранить до 14 дней в холодильнике при температуре 2—8 °С.
3. Стандарты В—Р восстановленные с концентрациями инсулина 3,0, 10,0, 30,0, 100,0 и 300,0 мкМЕ/мл соответственно: в каждый флакон добавить по 0,5 мл бидистиллированной воды. Хранить до

14. дней при температуре 2—8 “С.

4. Моющий раствор: концентрат моющего раствора растворить в 25 частях бидистиллированной воды.
5. Микротитрационные ячейки: отобрать для исследования необходимое количество стрипов с ячейками.
   Остальные стрипы поместить в защитный влагонепроницаемый пакет с десикантом.

Ход определения. Для регулярной аналитической процедуры в каждую ячейку микротитрационных стрипов пипеткой вносят по 25 мкл стандартов А—Е, контролей, исследуемой сыворотки (плазмы) крови (для аналитической процедуры широкого диапазона в ячейки вносят по 10 мкл стандартов, А, С—Р, контролей, исследуемой сыворотки (плазмы) крови). Добавляют по 100 мкл свежеприготовленного антител-энзимного конъюгатного раствора. Инкубируют ячейки при температуре 25 °С в течение 60 мин, встряхивая в шейкере микротитрационных плашек со скоростью 500—700 движений в 1 мин. Аспирируют и промывают ячейки 5 раз (по 350 мкл моющего раствора), после чего осушают плашку, переворачивая на абсорбирующий материал. В каждую ячейку вносят по 100 мкл ТМБ-хромогенного раствора и инкубируют ячейки в течение 10 мин при комнатной температуре (~ 25 °С), встряхивая в шейкере при 500—700 движений в 1 мин. Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл стоп-раствора (0,2 М раствор серной кислоты). Измеряют оптическую плотность растворов каждой ячейки с помощью имму- ноферментного плашечного анализатора при длине волны 450 и 620 нм. Результаты учитывают в течение 30 мин после добавления стоп-раствора.

Перед считыванием абсорбции необходимо установить прибор на «0» соответственно с нулевым стандартом (Blank).

Полученные значения стандартов инсулина используют для построения стандартной кривой, по которой определяют концентрацию гормона в исследуемых образцах.

При работе микропланшетного иммуноферментного анализатора с персональным компьютером и наличии соответствующего программного обеспечения стандартная кривая и результаты исследования проб сыворотки (плазмы) крови высчитываются автоматически.

Примечания. Концентрация стандартов приведена в мкМЕ/мл.

Для перевода в нг/мл необходимо знать:

25. мкМЕ/мл = 1 нг/мл, т.
    е. мкМЕ/мл • 0,04 = нг/мл. Сыворотка (предпочтительнее) или плазма крови без следов гемолиза. В качестве антикоагулянта используют гепарин. Кровь для получения плазмы центрифугируют (не позднее чем через

15. мин) в центрифуге с охлаждением при 4 °С. Отделяют сыворотку или плазму в пластиковые пробирки с крышками и замораживают при минус 20 или минус 70 °С. В герметически закрытой пробирке инсулин стабилен 1 день при 4—8 °С и 6 мес при минус 20 °С. Уровень инсулина в плазме выше, чем в сыворотке.

Клиническое значение. Инсулин секретируется (З-клет- ками островков Лангерганса поджелудочной железы. Инсулин — наиболее важный гормон, регулирующий жировой обмен, и единственный физиологический гормон, обусловливающий снижение уровня глюкозы в крови. Влияние гормона реализуется за мембранным типом — комплекс инсулин-рецептор повышает проницаемость клеточных мембран для глюкозы, обеспечивая этим ее переход из крови в ткани. Инсулин активирует фосфоглюкотрансферазу (гексокиназу) и таким образом обеспечивает превращение глюкозы в глюкозо-6-фосфат с последующим превращением глюкозы в гликоген. Конечным результатом влияния инсулина на обмен углеводов

является уменьшение концентрации глюкозы в крови (гипогликемия) и накопление гликогена в мышцах, печени и других органах. При дефиците инсулина клетки теряют способность к использованию глюкозы. Количество ее в крови увеличивается (гипергликемия).

Влияние инсулина на обмен липидов заключается в том, что он обеспечивает использование углеводов для синтеза высших карбоновых кислот, а из них — липидов. Кроме того, инсулин ингибирует тканевую липазу, в том числе и за счет торможения образования цАМФ, и этим сокращает расход липидов. Окисление жиров уменьшается, что приводит к ожирению организма.

При уменьшении секреции инсулина происходит повышенный распад аминокислот, усиливается окисление липидов (липолиз) с накоплением свободных жирных кислот, кетоновых тел и холестерола.

У здоровых собак уровень глюкозы в крови составляет 80—120 мг/100 мл (4,4—6,56 ммоль/л). Уровень гликемии выше 200 мг/100 мл (11,1 ммоль/л) считают характерным для сахарного диабета. У сухостойных коров содержание инсулина составляет около 20 мкМЕ/мл (К. Остин, Р. Шорт, 1987), за 60—45 дней до отела — 11,7—67,2 (35,2 ± 3,2) нмоль/л (Г. Г. Харута, 1999).