9.2.0ПРЕДЕЛЕНИЕТИР0КСИНА(Т4) в сыворотке КРОВИ (DIAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США)  

Реактивы: 96 микротитрационных ячеек (12 стрипов), внутренние стенки которых покрыты козьими антителами к мышиным у-глобулинам;

Т4-стандарты — 1 флакон (1,0 мл), маркированный А, содержит

0. мкг/дл тироксина и 5 флаконов (по 0,5 мл), маркированные В—F, содержат концентрации соответственно 0,5, 1,5, 5,0, 15,0 и

0. мкг/дл Т4 в человеческой сыворотке с нертутным консервантом;

Т4-контроли — 2 флакона по 0,5 мл каждый. Уровни I и II содержат высокую и низкую концентрации Т4 в человеческой сыворотке с нертутным консервантом;

Т4-ЭНЗИМНЫЙ конъюгатный концентрат — 1 флакон из темного стекла (0,3 мл) содержит Т4, конъюгированный с пероксидазой хрена в буфере с нертутным консервантом. Растворяют реагент непосредственно перед использованием;

антитела к Т4 — 1 флакон (11 мл) содержит мышиные моноклональные антитела к Т4 в буфере с нертутным консервантом;

буфер для приготовления конъюгата Т4-фермент — 1 флакон (11 мл) содержит белковый буфер с нертутным консервантом;

ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон из темного стекла (11 мл), содержащий тетраметилбензидин (ТМБ) в цитратном буфере с водорода оксидом;

концентрат моющего раствора — 1 флакон (105 мл) содержит поверхностно-активные вещества в фосфатно-солевом буферном растворе и консервант. Перед использованием развести в 10 частях дистиллированной воды;

стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 М раствор серной кислоты;

бидистиллированная вода.

Примечание.

Оборудование: микропланшетный имму ноферментный анализатор ^а! Рах-2100, настраиваемый на длину волны 450, 600 или 620 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) 81а1 Бах-2200, настраиваемый на 500—600 движений в 1 мин; автоматическое промывающее устройство 81а1 Бах-2600; полуавтоматические дозаторы объемом 5—50, 50—200 и 200—1000 мкл, наконечники; градуированная лабораторная посуда, полистириновые пробирки; фильтровальная бумага для просушивания стрипов; миллиметровая бумага для построения калибровочного графика (при отсутствии программного обеспечения).

Подготовка реагентов к анализу. 1. Рабочий раствор Т4-ЭНЗИМ- ного конъюгатного концентрата: в чистой посуде развести Т4-ЭН- зимный конъюгатный концентрат (1,0 мл) буфером для приготовления конъюгата (1 : 50). Например, для 96 ячеек необходимо растворить 220 мкл концентрата конъюгата в 11 мл буфера для приготовления конъюгата Т4-ЭНЗИМ (раствор готовят непосредственно перед применением; неиспользованный раствор конъюгата выливают).

2. Моющий раствор: 100 мл концентрата моющего раствора в колбе растворить в 900 мл бидистиллированной воды.
3. Микротитрационные ячейки: отобрать для исследования необходимое количество стрипов с ячейками. Остальные стрипы поместить в защитный влагонепроницаемый пакет с десикантом.

Ход определения. Перед использованием все реагенты и пробы должны быть приведены к комнатной температуре (-25 °С) и тщательно перемешаны. Образцы сыворотки крови, стандарты и контроли рекомендуется исследовать в дублях.

В используемые ячейки микропланшета дозатором вносят по 25 мкл стандартов, контролей и сыворотки крови. Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл свежеприготовленного Т4-энзимного конъюгатного раствора (1).

Проводят измерение оптической плотности раствора в ячейках при длине волны 450 нм (в течение 30 мин после добавления стоп-раствора).

Полученные значения стандартов Т4 используют для построения стандартной кривой, по которой определяют концентрацию тироксина в исследуемых образцах.

Примечание. Для перевода мкг/дл в нмоль/л необходимо мкг/дл • 12,9 = нмоль/л.

Клиническое значение. Тиреоидные гормоны (Т3 и Т4) синтезируются в фолликулярных клетках щитовидной железы путем присоединения йода к остаткам молекул аминокислоты тирозина, входящих в состав белка — тиреоглобулина (ТГ), который представляет собой крупный растворимый гликопротеин с молекулярной массой 660 кД. Ежедневная секреция щитовидной железой Т4 составляет 80—100 мкг, а Т3 — около 5 мкг.

При необходимости под влиянием протеазы и пептидазы лизо- сом фолликулярных клеток ТГ расщепляется, Т3 и Т4 секретиру- ются в кровь, где они связываются с белками плазмы. Т4 обладает высоким сродством к глобулину (тиронинсвязывающий глобулин — ТСГ), меньшим — к преальбумину и в небольших количествах связывается с альбумином (соответственно 75 % с ТСГ и 15—20 % — с пре- и альбумином). Лишь 0,05 % Т4 остается в свободном (несвязанном) состоянии. Т3 связывается практически только с ТСГ, а относительное количество его свободной фракции составляет 0,5 %. Т4 дольше сохраняется в крови — биологический период по- лужизни его составляет 7—9 дней, а Т3 — 2 дня. Связанные и свободные формы гормонов находятся в динамическом равновесии. Свободные йодтиронины относительно легко проникают сквозь мембрану клеток, влияя на все виды обмена веществ.

Около 85 % циркулирующего в крови Т4 дейодируется в печени и почках с образованием почти 80 % суточного количества Т3.

Содержание общего Т4 у коров колеблется в пределах 50—100 нмоль/л (В. В. Сахнюк, 2003), Т3 — 1,5—2,5, у телят старше 10-дневного возраста соответственно 50—150 и 2,0—3,5 нмоль/л. При клинически выраженном гипертиреозе содержание Т3 и Т4 повышено, а при гипотиреозе — снижено (у коров содержание Т3 составляет 0,23—1,9 нмоль/л, Т4 — 14,0—52 нмоль/л (В. П. Фасоля, 1996; В. JI. Романюк, 2000). В большинстве случаев уровень Т3 коррелирует с содержанием Т4. У телят с врожденным зобом выявлена гиперфункция щитовидной железы. Прежде всего увеличивается содержание Т3 (В. JI. Романюк, 2002).

Функция щитовидной железы изменяется при некоторых болезнях внутренних органов: уменьшение содержания ее гормонов установлено при бронхопневмонии телят, остеодистрофии, кетозе и гепатодистрофии коров, т. е. развивается так называемый феномен «нормальной больной щитовидной железы».

В настоящее время наблюдается тенденция к определению свободного Т4 у людей как одного из основных маркеров функционального состояния щитовидной железы. В ветеринарии этот тест не нашел еще своего места.