ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЛЬЦИТОНИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  

Реактивы: 96 полистириновых микротитрационных ячеек с козьими антикальцитониновыми IgG, иммобилизированными на боковых стенках каждой ячейки;

стандарты кальцитонина (лиофилизированные) — 1 флакон (3,0 мл), обозначенный А, с концентрацией 0 пг/мл; 4 флакона (по 1 мл каждый), обозначенные В—F, с концентрациями 10,0; 50,0; 250,0 и 600 пг/мл кальцитонина в буфере с нертутным консервантом;

контроли кальцитонина (лиофилизированные) — 2 флакона по 1 мл с уровнями I и II, содержащие низкую и высокую концентрации кальцитонина в буфере с нертутным консервантом;

кальцитониновый антител-биотиновый конъюгатный концентрат — 1 флакон содержит 0,4 мл биотинмеченого концентрата кальцитонина в протеиновом буфере с нертутным консервантом. Растворить за 10—15 мин перед использованием в аналитическом буфере;

стрептавидин-энзимный конъюгатный концентрат — 1 темный флакон (0,3 мл) содержит стрептавидин-ХПО концентрат в протеиновом буфере с нертутным консервантом. За 5—10 мин до исследования растворяют 1 часть реагента в 50 частях аналитического буфера О;

аналитический буфер 0—1 флакон (22 мл) содержит буфер с нертутным консервантом;

ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон (11 мл) содержит раствор тетраметиленбензидина (ТМБ) в цитратном буфере с пероксидом водорода;

моющий концентрат I — 1 флакон (100 мл) содержит буферные соли с неионным детергентом.

стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 М раствор серной кислоты;

деионизированная и бидистиллированная вода.

Примечание. Все реагенты и пробы перед исследованием следует привести к комнатной температуре (25 °С) и тщательно перемешать путем аккуратного вращения флаконов. Антикоагулянты — гепарин, ЭДТА (1,5 мл/кг), стабилизированные апротинином (тра- сиполот) из расчета 40 КИЕ/мл (калликреининги- бирующих единиц). В таких условиях кальцитонин в крови стабилен в течение 1 ч при комнатной температуре (Сис1ог М. и соавт., 1996). Предпочтительна плазма без гемолиза и липемии. После взятия кровь немедленно помещают в воду со льдом и тотчас доставляют в лабораторию или центрифугируют, немедленно сливают плазму и замораживают при минус 20 °С или минус 70 °С. Избегать повторного замораживания и размораживания исследуемых проб.

Оборудование: микропланшетный иммуноферментный анализатор, настраиваемый на длину волны 450 нм и перенастраиваемый на 600 или 620 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) для микропланшет на 500—700 встряхиваний в 1 мин; автоматическое промывающее устройство; полуавтоматические пипетки на 50 и 100 мкл; фильтровальная бумага для просушивания стрипов; миллиметровая бумага для построения стандартной кривой (при отсутствии программного обеспечения).

Подготовка реагентов к анализу. 1. Моющий раствор: моющий концентрат развести бидистиллированной водой в соотношении 1:10.

2. Кальцитониновый антител-биотиновый конъюгатный раствор: кальцитонин-биотиновый конъюгатный концентрат развести в аналитическом буфере Б (1:50). Для полной плашки на 96 проб необходимо отобрать точно 220 мкл кальцитонин-биотинового конъюгатного концентрата и 11 мл аналитического буфера О.

Примечание. Реагент необходимо разводить не более чем за 10—15 мин до начала исследования.

3. Стрептавидин-энзимный конъюгатный раствор: стрептави- дин-энзимный конъюгатный концентрат развести в аналитическом буфере О в соотношении 1:50 соответственно количеству используемых ячеек.
   Для полной плашки на 96 проб необходимо 220 мкл концентрата развести в 11 мл аналитического буфера О.

Примечание. Реагент разводят за 5—10 мин до начала исследования.

4. Микротитрационные ячейки: отобрать необходимое количество ячеек для исследований. Неиспользуемые ячейки поместить в пакет и тщательно его закрыть.

Ход определения.В используемые ячейки вносят по 100 мкл стандартов, контролей и исследуемых проб сыворотки (в параллелях) и добавляют в каждую ячейку по 100 мкл кальцитонинового антител-биотинового конъюгатного раствора. Ячейки инкубируют на протяжении 60 мин, встряхивая в шейкере микроплат (500—700 встряхиваний в 1 мин) при комнатной температуре (22—25 °С). После инкубации ячейки 5 раз промывают при помощи автоматического промывающего устройства, используя по 350 мкл моющего раствора. На последнем этапе используют двойную аспирацию (двойная откачка содержимого из одной лунки). При необходимости удаляют остатки жидкости, переворачивая плашку со стрипами на фильтровальную бумагу. Полуавтоматической пипеткой в каждую ячейку вносят по 100 мкл стрептавидин-энзимного конъюгатного раствора. Инкубируют в инкубаторе-шейкере при том же режиме (22—25 °С, 500—700 встряхиваний в 1 мин) 30 мин. Аспирируют и пятикратно промывают плашку моющим раствором по 350 мкл. Осушают ячейки на фильтровальной бумаге. В каждую ячейку вносят по 100.мкл ТМБ-хромогенного раствора и инкубируют 10—12 мин (22—25 °С, 500—700 встряхиваний в 1 мин), избегая попадания на плашку прямых солнечных лучей. Пипеткой добавляют в каждую ячейку по 100 мкл стоп-раствора (0,2 М раствор серной кислоты) для остановки цветной реакции. Плашку со стрипами помещают в иммуноферментный анализатор (ридер) и в режиме двойного излучения (вначале при 450 нм, затем при 620 нм) считывают абсорбцию растворов в ячейках (не позднее 30 мин после добавления стоп-раствора).

По полученным значениям стандартов строят стандартную кривую, по которой определяют концентрацию кальцитонина в исследуемых пробах сыворотки.

Примечание.

Для перевода в пмоль/л необходимо пг/мл х х 0,29 = пмоль/л.

Клиническое значение. Кальцитонин продуцируют па- рафолликулярные клетки (С-клетки) щитовидной железы и в понятие «тиреоидные гормоны» обычно не включается. Он не содержит йода и представляет собой полипептид из 32 аминокислотных остатков. Кальцитонин непосредственно влияет на костную ткань и почки, где расположены его рецепторы, соответственно на остеокласты и на клетки тонкого сегмента восходящего колена петли Ген- ле и начала дистальных извитых канальцев. Он снижает уровень кальция в крови, когда тот превышает 2,5 ммоль/л. Тормозя активность остеокластов; кальцитонин угнетает резорбцию костей, что сопровождается гипокальциемией, гипофосфатемией и снижением активности щелочной фосфатазы. В почках кальцитонин увеличивает экскрецию кальция и фосфора.

Секрецию кальцитонина в физиологических условиях регулирует, по-видимому, только уровень кальция в сыворотке крови. Сведения о содержании кальцитонина в сыворотке крови животных ограничены. У клинически здоровых коров кальцитонина в сыворотке крови содержится 4,11 ± 0,13 пг/мл, у больных послеродовой гипокальциемией несколько ниже (И. Ф. Гаджаев, 1986).