Определение содержания неэтерифицированных жирных кислот (НЭЖК) в сыворотке (плазме) крови (по Лауреллу и Тибблингу).  

Реактивы: экстрагирующая смесь (ЭС) хлороформ-гептан

4. : 3 (по объему), содержащая 2 % метанола;

кремниевая кислота порошкообразная, предварительно активированная при 120 °С 12 ч;

меднотриэтаноламиновый реактив (Си-ТЭА).

4%-ный раствор дифенилкарбазида (ДФК) в этаноле. Готовят ежедневно. Непосредственно перед применением 0,1 мл 1 моль/л ТЭА добавляют к 10 мл 0,4%-ного раствора ДФК;

стандартные растворы пальмитиновой кислоты (а. м. = 256,42) — 0,005 и 0,001 мкмоль/л. Для этого 25,642 мг пальмитиновой кислоты растворяют в 100 мл ЭС, получают 1 ммоль/л раствор. Затем 1 мл данного раствора доводят до 10 мл ЭС в мерной колбочке, получают 0,1 мкмоль/л. Далее из данного раствора путем разведения ЭС получают растворы с концентрацией 0,005 и 0,010 мкмоль/л пальмитиновой кислоты.

Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; пробирки с притертыми пробками на 15—20 мл; центрифужные пробирки с притертой пробкой на 10 мл; встряхиватель. Стеклянную посуду, предназначенную для определения НЭЖК, выдерживают несколько часов в 1 моль/л растворе НС1 и тщательно моют деминерализованной водой.

Ход определения. В пробирку с притертой пробкой вносят 250 мг активированной кремниевой кислоты с последующим внесением 9 мл ЭС и по 0,075 мл сыворотки (плазмы). Пробирки немедленно закрывают, закрепляют со штативом в горизонтальном положении на встряхивателе и встряхивают 10 мин, затем дают 15 мин постоять и вновь встряхивают 1—2 мин (можно вручную).

Одновременно готовят стандарт.

9. мл ЭС, во вторую 9 мл 0,005 мкмоль/л и в третью 9 мл 0,010 мкмоль/л раствора пальмитиновой кислоты. Пробирки стандарта встряхивают вместе с пробами. Затем пробирки центрифугируют 10 мин при 2500—3000 мин и 5 мл верхней фазы переносят в пробирки с притертой пробкой, куда добавляют 2 мл раствора Си-ТЭА. Опять встряхивают и центрифугируют. После этого 3 мл верхней фазы (осторожно, не касаясь стенок и нижнего слоя) пе

реносят в обычную пробирку (опыт и контроль) и добавляют по 0,5 мл раствора ДФК, перемешивают и оставляют стоять в темном месте. Через 15 мин развивается розово-малиновая окраска, интенсивность которой измеряют на ФЭКе или спектрофотометре при длине волны 550 нм против воды.

Расчет ведут по формуле

х = (Л/В) ¦ 120,

где х — содержание НЭЖК, мкмоль/л; А — показатель пробы, мкмоль/л; В — показатель стандарта, мкмоль/л; 120 — постоянный коэффициент.

Перед расчетом из показаний экстракции стандартной пробы (0,010 мкмоль) следует вычесть показания экстинкции слепой пробы.

Расчет можно проводить и по калибровочному графику, который строят с использованием раствора пальмитиновой кислоты в пределах 0,005—0,025 мкмоль/л.

Клиническое значение. Концентрация НЭЖК в сыворотке крови (см. приложение 5) тесно связана с энергетической обеспеченностью организма животных и характеризует активность процессов мобилизации их из жировых депо. Поэтому при недостаточном поступлении энергии в организм, особенно в период раздоя, у самок птиц перед началом яйцекладки и в других случаях концентрация НЭЖК в сыворотке крови соответственно возрастает в 5—10 раз и более. Часто это предшествует параллельному увеличению концентрации кетоновых тел в крови.

Кратковременное повышение концентрации НЭЖК в сыворотке крови может быть результатом кормления по рационам, обогащенным кормовыми жирами; под влиянием инъекций адреналина; под воздействием стрессовых ситуаций; при сахарном диабете, ожирении, кетозе.

Источник: 4.

Определение содержания общего холестерина в сыворотке крови.

Принцип. В основу метода положена модифицированная Иль- ком реакция Любермана—Бурхарда, которая дает изумрудно-зеленое окрашивание в присутствии холестерина и смеси ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты. Данный метод позволяет определять содержание холестерина без предварительной экстракции липидов из сыворотки крови.

Реактивы: 1) смесь ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты (1:5: 1). При смешивании ингредиентов следует избегать нагревания смеси. Для этого колбу, в которой готовят реактив, помещают в сосуд со льдом, а серную кислоту добавляют в последнюю очередь медленно по каплям, постоянно помешивая. Смесь должна быть бесцветной или слегка желтого цвета и сохраняться в холодильнике;

2. стандартный раствор холестерина: 100 мг холестерина в 100 мл хлороформа.

Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; термостат; пробирки; штатив для пробирок; пипетки мерные на 0,1 и 5 мл.

Ход определения. К2мл реактива 1 добавляют 0,1 мл негемолизированной сыворотки, встряхивают короткими энергичными движениями и помещают в термостат на 20 мин при 37 °С. Окрашенную в зеленый цвет жидкость колориметрируют на спектрофотометре (длина волны 650—660 нм) или на ФЭКе (красный светофильтр) в кюветах диаметром 0,5 см против контрольной пробы на реактивы (вместо сыворотки вносят 0,1 мл воды).

Расчет ведут по предварительно составленному калибровочному графику. Рабочий раствор холестерина готовят разведением стандартного в 10 раз (10 мл стандартного раствора + 90 мл хлороформа). 1 мл рабочего раствора содержит 0,1 мг холестерина. Затем в пробирки вносят по 0,1; 0,25; 0,50; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 и 3 мл рабочего раствора, что соответствует 0,025; 0,05; 0,10; 0,20; 0,25 и 0,30 мг холестерина.

При постановке реакции используют абсолютно чистые и совершенно сухие пипетки и пробирки. Соотношение ингредиентов реактива рассчитано так, что белки сыворотки не выпадают в осадок. Появление мути может быть вызвано только наличием воды в реактиве или посуде.

При исследовании холестерина в экстракте липидов его вносят в пробирку в объеме, содержащем не более 1—5 мг чистых липидов.

Клиническое значение. Холестерин в сыворотке крови животных находится в двух формах: свободной (1/3) и эфирносвязанной с различными жирными кислотами (2/3). С возрастом концентрация холестерина (см. приложение 5) возрастает. Ги- перхолестеринемия отмечается при диабете, нефрозах, пониженной функции щитовидной железы; в начале голодания; у свиней и птицы — при скармливании рационов, обогащенных твердыми кормовыми жирами. При острых гепатитах уровень общего холестерина в начале заболевания обычно повышается, а затем падает ниже нормы. Для заболевания печени характерно падение эфирной фракции холестерина. Острое падение этой фракции в крови — плохой прогностический признак, указывающий на острую желтую атрофию печени или острое отравление ее.

Определение содержания этерифицированного холестерина в сыворотке крови (по Балаховскому). Принцип. Метод основан на связывании свободного холестерина дигитонином (благодаря чему образуется нерастворимое в хлороформе соединение) и растворении хлороформом эфирносвязанного холестерина. Хлороформенный экстракт, содержащий эфирносвязанный холестерин, используется для цветной реакции с реактивом Илька (или с другим специфическим реактивом).

Реактивы: 1) экстрагирующая смесь (ЭС: хлороформ-метанол 2 : 1 или этанол-эфир 3:1);

2. 1%-ный спиртовой раствор дигитонина. 1 г дигитонина растворяют в 50 мл этилового спирта и доводят до 100 мл дистиллированной водой с подогревом;
3. смесь ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты (1 : 5 : 1).
   Готовят, как описано выше.

Оборудование: центрифужные пробирки; пробирки с притертыми пробками на 10 мл; пипетки на 0,1, 1 и 5 мл; штатив для пробирок; водяная баня; центрифуга; ФЭК или спектрофотометр.

Ход определения. 0,1 мл сыворотки (плазмы) крови вносят в центрифужную пробирку, содержащую 5 мл ЭС, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и оставляют стоять на 5—10 мин при использовании хлороформ-метаноловой смеси или на 1 ч при использовании спирто-эфирной смеси. Затем центрифугируют в течение 10—15 мин при 2000—3000 мин ’. Центрифу- гат осторожно сливают в пробирку с притертой пробкой и ставят в водяную баню для выпаривания (не досуха, оставляют 0,5—1 мл центрифугата). Прибавляют 1 мл раствора дигитонина и перемешивают. Образуется белый налет — комплекс свободного холестерина с дигитонином. Оставляют стоять на 2—3 ч (или на ночь), после чего выпаривают досуха. После охлаждения в пробирку добавляют 5 мл хлороформа, тщательно взбалтывают. Хлороформенный экстракт фильтруют через обезжиренный бумажный фильтр или сливают после центрифугирования и используют для цветной реакции. С этой целью экстракт упаривают до минимума, добавляют 2 мл реактива 3, ставят в темное место на 20 мин, после чего колориметрируют. Хлороформ извлекает эфир холестерина, но не растворяет ни дигитонин-холестериновый комплекс, ни избыточный дигитонин.

Расчет ведут по калибровочной прямой, составленной для общего холестерина. По разности между общим и связанным находят количество свободного холестерина.

Клиническое значение. В норме доля эфирносвязанного холестерина в сыворотке крови животных достигает 70—90, у птиц 60—70 %. В результате все изменения его содержания отражают главным образом состояние печени и поджелудочной железы, где синтезируется эта фракция. Снижение данной фракции часто является следствием поражения синтетической функции печени и (или) поджелудочной железы.