ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАТИРЕОИДНОГО ГОРМОНА (ПТГ) В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  

Реактивы: 96 полистироловых микротитрационных ячеек, покрытых анти-И-ПТГ;

И-ПТГ стандартный растворитель — 1 флакон (1 мл), обозначенный А, содержит 0 нг/мл И-ПТГ в буферной основе с нертутным консервантом;

И-ПТГ стандарты — 6 флаконов по 0,5 мл (В—G) с концентрациями 10,0, 30,0, 100,0, 250,0, 750,0 и 2000 пг/мл в буферной основе с нертутным консервантом;

И-ПТГ контроли — 2 флакона по 1 мл с уровнями I и II, содержащие низкую и высокою концентрацию И-ПТГ в буферной основе с нертутным консервантом;

И-ПТГ аналитический буфер — 1 флакон (11 мл) содержит фосфатно-буферную основу с нертутным консервантом;

И-ПТГ антител-биотиновый конъюгат — 1 флакон (И мл) содержит анти-И-ПТГ антитела, конъюгированные с биотином в протеиновом буфере с нертутным консервантом;

стрептавидин-энзимный конъюгатный концентрат — 1 флакон (0,3 мл) содержит стрептавидин-энзимный конъюгат с нертутным консервантом. Развести за 10—15 мин перед использованием в И-ПТГ аналитическом буфере;

ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон (11 мл) содержит раствор тетраметил бензидина (ТМБ) в цитратном буфере с гидроген- пероксидазой;

моющий концентрат — 1 флакон (100 мл) содержит буферные соли с неионизированными детергентами;

стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 М раствор серной кислоты;

деионизированная или бидистиллированная вода.

Примечание.

Оборудование: микропланшетныйиммуноферментныйанализатор, настраиваемый на длину волны 450 нм и перенастраиваемый на 600 или 620 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) для микропланшет, настроенный на 500—700 встряхиваний в 1 мин; автоматическое промывающее устройство; полуавтоматические пипетки объемом 50 и 100 мкл; фильтровальная бумага для просушивания стрипов; миллиметровая бумага для построения калибровочного графика (при отсутствии программного обеспечения).

Подготовка реагентов к анализу. 1. Моющий раствор: десятикратно развести моющий концентрат бидистиллированной водой (соотношение 1:9).

2. Стрептавидин-энзимный конъюгатный раствор: стрептавидин-энзимный конъюгатный концентрат развести в соотношении 1:50 конъюгатным растворителем соответственно количеству используемых ячеек. Для полной плашки на 96 проб необходимо 240 мкл концентрата развести в 12 мл конъюгатного растворителя.

Примечание. Антител-стрептавидин-конъюгатный концентрат разводят непосредственно перед исследованием.

3. Микротитрационные ячейки: отобрать для исследования необходимое количество стрипов с ячейками. Неиспользуемые стри- пы поместить во влагонепроницаемый пакет с десикантом.

Ход определения. В используемые ячейки вносят по 50 мкл стандартов, контролей и исследуемых проб сыворотки (плазмы) крови (в параллелях). Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл антител-биотинового конъюгата. Инкубируют ячейки при комнатной температуре (21—25 °С) в течение 2,5 ч, встряхивая в шейкере микроплат (500—700 встряхиваний в 1 мин).

Примечание. Окраска в ячейках может развиваться быстрее или медленнее чем за время, рекомендованное для комнатной температуры, поэтому необходимо визуально наблюдать за развитием окраски для установления оптимального времени инкубации.

После инкубации в каждую ячейку полуавтоматической пипеткой добавляют по 100 мкл стоп-раствора (0,2 М раствор серной кислоты) для остановки цветной реакции. Измеряют оптическую плотность стандартов, контролей и исследуемых образцов на пла- шечном иммуноферментном анализаторе (ридере) в режиме двойного излучения: при X равно 450 нм и 620 нм (не позднее 30 мин после добавления стоп-раствора).

Полученные значения стандартов ПТГ используют для построения стандартной кривой, по которой определяют концентрацию гормона в исследуемых пробах.

Примечание. Все основные характеристики приведены в пг/мл.

Для перевода в 81 (нмоль/л) необходимо пг/мл х х 0,11 = нмоль/л.

Клиническое значение. Паратгормон совместно с каль- цитонином и активными метаболитами витамина Б регулирует гомеостаз кальция в организме, что осуществляется путем усиления трансмембранного транспорта кальция из кишечника [совместно с 1,25 (ОН)2Вз], повышения реабсорбции кальция в дистальных отделах почечных канальцев и усиления резорбции костной ткани. При снижении содержания кальция в сыворотке крови по принципу обратной связи увеличивается секреция ПТГ, что, в свою очередь, повышает синтез 1,25(ОН)2Оз, а последний усиливает резорбцию костной ткани путем повышения активности остеокластов, всасывание кальция в кишечнике через регуляцию синтеза СаСБ и его реабсорбцию в дистальных канальцах почек (JI. И. Апуховская с соавт., 2003).

В крови клинически здоровых коров перед отелом содержание па- ратгормона составляет 4,36 ± 0,19 нг/мл, при послеродовой гипокаль- циемии — 1,11 ± 0,12 нг/мл (И. Ф. Ганджаев, 1986). У коров с оптимальным содержанием кальция в сыворотке крови (2,26—2,4 ммоль/л) уровень паратгормона составляет 6,1—59,8 пг/мл (О. Ю. Голуб, 2003).