9.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИЙОДТИРОНИНА (Т3) В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США) 

Принцип. Метод основан на ферментном иммуноанализе, в основе которого лежит конкуренция немеченных и меченных ферментом антигенов за определенное число антигенсвязывающих участков антител.

Реактивы: 96 полистириновых микротитрационных ячеек (плашка), внутренние стенки которых покрыты сывороткой с антителами овцы к Тз;

стандарты трийодтиронина — 6 флаконов по 1,0 мл в каждом, обозначенные A—F, содержащие концентрации Т3 соответственно

0. нг/дл, 50, 100, 250, 500 и 750 нг/дл в бычьей альбумин-стабили- зированной основе;

Тз-контроли — 2 флакона по 0,5 мл. Уровни I и II, содержащие высокую и низкую концентрации Т3 в бычьей альбумин-стабили- зированной основе с нертутным консервантом;

Тз-энзимный конъюгатный концентрат — 1 флакон (1,0 мл), содержащий конъюгат трийодтиронинпероксидазы хрена в бычьей альбумин-стабилизирующей основе; содержит консервант;

буфер для приготовления конъюгата Тз-энзим (красный) —

1. флакон (11 мл) содержит буфер с консервантом и связанные с протеином ингибиторы;

ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон (11 мл) содержит тетра- метилбензидин (ТМБ) в цитратном буфере с пероксидом водорода;

концентрат моющего раствора — 1 флакон (105 мл) содержит поверхностно-активные вещества в фосфатно-солевом буферном растворе и консервант;

стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 М раствор серной кислоты.

Примечание. Образцы крови помещают в воду со льдом и немедленно доставляют в лабораторию, где быстро отделяют сыворотку или плазму эритроцитов.

Оборудование: микропланшетный иммуноферментный анализатор 81а1 Рах-2100, настраиваемый на длину волны 450 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) 81а1 Рах-2200, настраиваемый на 500—700 движений в 1 мин; автоматическое промывающее устройство 81а1 Рах-2600; полуавтоматические дозаторы объемом 5—50, 50—200 и 200—1000 мкл, наконечники; градуированная лабораторная посуда, полистириновые пробирки; фильтровальная бумага для просушивания стрипов; бидистиллированная вода; миллиметровая бумага для построения калибровочного графика (при отсутствии программного обеспечения).

Подготовка реагентов к анализу. 1. Рабочий раствор Т3-энзим- ного конъюгатного концентрата: в чистой посуде развести Т3-энзимный конъюгатный концентрат (1,0 мл) буфером для приготовления конъюгата (1:11). Например, для 16 ячеек необходимо 160 мкл (0,16 мл) конъюгата растворить в 1,6 мл буфера (раствор готовят с небольшим запасом и используют в течение 24 час).

2. Моющий раствор: 100 мл концентрата моющего раствора в колбе растворить в 900 мл бидистиллированной воды.
3. Микротитрационные ячейки: отобрать для исследования необходимое количество стрипов с ячейками. Остальные стрипы поместить в защитный влагонепроницаемый пакет с десикантом.

Ход определения. В используемые ячейки микротитраци- онных стрипов пипеткой вносят по 50 мкл стандартов, контролей, исследуемой сыворотки крови. В каждую ячейку добавляют по 100 мкл свежеприготовленного рабочего раствора Тз-энзимного конъюгатного концентрата.

Измеряют оптическую плотность растворов каждой ячейки с помощью иммуноферментного плашечного анализатора при длине волны 450 нм. Результаты учитывают в течение 30 мин после добавления стоп-раствора. При возможности для более точного измерения абсорбции необходимо установить прибор на измерение двойного излучения при длине волны 450 нм с последующей перенастройкой на 600 или 620 нм.

Полученные значения стандартов Т3 используют для построения стандартной кривой, по которой определяют концентрацию трийодтиронина в исследуемых образцах. Стандартная кривая должна быть включена в каждое исследование.

При работе микропланшетного иммуноферментного анализатора с персональным компьютером и наличии соответствующего программного обеспечения стандартная кривая и результаты исследования проб сыворотки (плазмы) крови высчитываются автоматически.