Определение активности креатинкииазы (КК) в сыворотке (плазме) крови с использованием креатинфосфата в качестве субстрата. 

Реактивы: трис-(оксиметил)-аминометан (трис, х.

магния сульфат (ч. д. а.);

трис-буфер, 0,1 моль/л, pH 7,4, содержащий 0,015 моль/л М§2+ (в виде Г^БО,*). 1.2 г триса и 0,180 г              помещают в мерную

колбу на 100 мл и доливают водой до метки. Раствор стабилен в течение 1 мес при хранении в холодильнике;

0,012 моль/л раствор креатинфосфата динатриевой соли, pH 7,4. Растворяют 0,044 г креатинфосфата в 10 мл воды. Раствор стабилен 1 нед при хранении в холодильнике;

0,004 моль/л раствор аденазин-5-дифосфорной кислоты натриевой соли, pH 7,4. 0,017 г аденозиндифосфата натрия (мол. масса

449) растворяют в 100 мл воды. Раствор стабилен 1 нед при хранении в холодильнике;

50 г/л раствор бария гидроксида восьмиводного (ч. д. а. или х. ч.). 5 г безводного бария гидроксида или 8 г восьмиводного бария гидроксида помещают в мерную колбу на 100 мл и доливают объем до метки водой, не содержащей С02;

50 г/л раствор цинка сульфата (ч. д. а., х. ч.). 5 г цинка сульфата помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой, не содержащей С02;

а-нафтол (1-нафтол, ч. д. а.);

натрия карбонат (ч. д. а.);

натрия гидроксид (ч. д. а.);

10 г/л раствор а-нафтола. 1 г а-нафтола, 16 г натрия карбоната и 6 г натрия гидроксида помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки водой. Раствор готовят не ранее чем за 2 ч до использования;

основной раствор диацетила в этиловом спирте. 0,2 мл диацетила растворяют в 20 мл этилового спирта;

рабочий 0,5 г/л раствор диацетила. К 1 мл основного раствора приливают 20 мл дистиллированной воды.

основной калибровочный раствор креатина. 0,131 г креатина помещают в мерную колбу на 100 мл и доливают водой до метки;

рабочий калибровочный 150 мкмоль/л раствор креатина. 1,5 мл основного раствора креатина помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят объем водой до метки. Раствор хранят в холодильнике.

Оборудование: спектрофотометр или фотоэлектроколориметр; мерные колбы; термостат; секундомер.

Ход определения. 0,3 мл буфера, 0,3 мл раствора креатин- фосфата, 0,1 мл сыворотки крови нагревают 5 мин при 37 °С. Добавляют 0,3 мл раствора натрия аденозиндифосфата и инкубируют 30 мин при 37 “С. После инкубации добавляют по 0,5 мл растворов бария гидроксида и цинка сульфата, центрифугируют 15 мин при 3000—4000 мин-1. К 1 мл центрифугата добавляют 1 мл воды, 1 мл раствора а-нафтола, 0,5 мл раствора диацетила. Для развития окраски пробу помещают в термостат на 30 мин. Измеряют при 520 нм (зеленый светофильтр).

Холостую пробу ставят так же, как и опытную, но вместо раствора аденозиндифосфата натрия добавляют воду.

Для калибровочной пробы 0,3 мл буфера, 0,3 мл раствора аденозиндифосфата, 0,4 мл рабочего раствора креатина обрабатывают так же, как опытную пробу. Измеряют против холостой пробы. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо креатина берут воду.

Расчет производят по формуле

Х = С^ОП — ^ХОл)/(^К _ ^хол) ' 333,

где х — активность креатинкиназы, нмоль/с • л; Еоп — экстинкция опытной пробы;

ол — экстинкция холостой пробы; Ек — экстинкция калибровочной пробы; 333 — коэффициент пересчета креатинфосфата, преформированного 1 л сыворотки за 1 с на наномоли.

Примечания. 1. Берут свежую свободную от гемолиза кровь или плазму с ЭДТА или гепарином. Образцы крови в лабораторию доставляют как можно скорее. Сыворотку хранят в закрытых пробирках в темноте в течение 2 дней при температуре не выше 20—25 °С. 2. Определение активности креатинкиназы в сыворотке крови можно проводить унифицированным методом с использованием креатина в качестве субстрата.

Источники: 43, 69.

Клиническое значение. КК катализирует обратимую реакцию фосфорилирования креатина. Повышение активности КК отмечается при повреждении сердечной или скелетных мышц. При повреждении сердечной мышцы ее активность у человека повышается в 20—30 раз по сравнению с нормой, при повреждении скелетных — еще больше.

При определении активности КК в сыворотке крови животных следует сравнивать величины у клинически здоровых и больных животных. Резкое повышение КК очевидно при миоглобинурии, травматическом перикардите, хирургических заболеваниях (травмах). У новорожденных активность КК выше, чем у взрослых.