Определение токоферолов в плазме крови с а,а'-дипиридилом (2, 2'-дипиридил).  

Реактивы: абсолютный этиловый спирт, перегнанный над таблетками калия гидроксида (КОН) и кристаллами калия перманганата (КМПО4). Очистка от альдегидов: этиловый спирт перегоняют над таблетками КОН и кристаллами КМПО4, выбрасывая первую и последнюю фракции (до 10 % общего объема);

концентрированный раствор калия гидроксида (КОН) — 50 г КОН в 50 мл дистиллированной воды;

10%-ный раствор кислоты аскорбиновой в дистиллированной воде. Готовят непосредственно перед опытом и нейтрализуют несколькими каплями концентрированной КОН;

0,3%-ный раствор а,а'-дипиридила в н-пропиловом спирте. Сохраняют в склянке из темного стекла;

ксилол очищенный (х. ч.). Препарат встряхивают в делительной воронке с 3—4 порциями концентрированной серной кислоты (Н2804), пока кислотный слой не перестанет окрашиваться, промывают водой, насыщенным раствором перманганата калия, вновь водой до удаления окраски КМПО4, сушат над безводным 1Ма2804 и перегоняют, отбрасывая первые и последние 10 % отгона;

0,12%-ный раствор РеС1з • 6Н20 в абсолютном этиловом спирте. Сохраняют в темной склянке;

0,Ь-а-токоферол, калибровочный раствор в абсолютном спирте этиловом концентрацией 100 мкг/мл.

Оборудование: фотоэлектроколориметр или спектрофотометр; пробирки 18 х 1,5 см с притертыми пробками; пробирки центрифужные; центрифуга.

Ход определения свободного токоферола. К 2 мл плазмы (сыворотки) крови приливают 1 мл дистиллированной воды и 3 мл абсолютного этилового спирта, добавляемого по каплям при перемешивании.

2. мин фотометрируют при длине волны 520 нм против воды. Одновременно таким же образом обрабатывают контроль на реактивы, содержащий вместо плазмы (сыворотки) крови 2 мл воды. Для определения содержания токоферолов рассчитывают оптическую плотность токоферолов по формуле

°е = ^520 - (Ас + 0,217)/?4бо,

где Бе — оптическая плотность токоферолов; Я520 ~ оптическая плотность опытной пробы при 520 нм; Як — оптическая плотность контрольной пробы при 520 нм; 0,217 — экспериментально определенная поправка на оптическую плотность, обусловленную присутствием каротиноидов; Д^о — оптическая плотность опытной пробы при 460 нм.

Концентрацию свободного токоферола рассчитывают по калибровочной кривой, для построения которой используют калибровочный раствор 0,Ь-а-токоферола при содержании последнего от 10 до 100 мкг в пробе.

Ход определения суммарного токоферола и его эфиров. В пробирках 18 х 1,5 см с притертыми пробками смешивают 2 мл плазмы (сыворотки) крови, 1 мл 10%-ного раствора аскорбиновой кислоты, 0,2 мл концентрированной КОН и 3 мл абсолютного спирта. Вносят в пробирки шарики или осколки кварцевого стекла, накрывают их небольшими воронками и помещают на 10 мин в кипящую водяную баню так, чтобы пробирки были углублены в воду на 2 см. Верхнюю часть пробирок охлаждают током воздуха из воздуходува. Через 10 мин пробирки охлаждают холодной водой, добавляют 5 мл ксилола, интенсивно перемешивают 8 мин, центрифугируют 5—10 мин при 3000 мин и далее обрабатывают, как описано выше.

Содержание эфиров токоферола рассчитывают по разности между количеством суммарного и свободного токоферола. По данным ряда авторов, содержание свободного токоферола в плазме крови в 6—6,5 раза больше эфиров.

Примечания. 1. Желательно работать в затемненном помещении и проводить фотометрирование через строго определенное время после добавления дипириди- ла, так как окраска нестабильна. 2. Сыворотку (плазму) крови можно хранить при комнатной температуре в течение 1 сут, при 5 °С 2 нед и при минус 20 °С 2 мес.

Источник: 75.