ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИРЕОТРОПИНА (ТТГ) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DYAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США)  

Реактивы: 96 полистириновых микротитрационных ячеек, покрытых анти-чТТГ-антителами;

ТТГ-стандарты — 1 флакон (А, 1 мл) содержит 0 мкМЕ/мл, 5 флаконов по 0,5 мл (В—F) с концентрациями 0,15, 0,70, 2,00, 7,50 и 22,00 мкМЕ/мл ТТГ в сыворотке свиньи с нертутным консервантом;

ТТГ-контроли — 2 флакона по 0,5 мл каждый. Уровни I и II содержат высокую и низкую концентрации ТТГ в сыворотке свиньи с нертутным консервантом;

аналитический буфер В — 1 флакон (11 мл) содержит протеиновый буфер с нертутным консервантом;

ТТГ-антител-энзимный конъюгатный концентрат — 1 флакон из темного стекла (0,3 мл) содержит анти-чТТГ-антитела, конъюгированные с энзимами пероксидазы хрена в протеиновом буфере с нертутным консервантом (перед использованием необходимое количество концентрата в зависимости от количества исследуемых образцов растворяют в конъюгатном растворителе;

ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон (11 мл) содержит тетра- метилбензидин в цитратном буфере с пероксидом водорода;

моющий концентрат — 1 флакон (100 мл) содержит буферный солевой раствор с неионным детергентом. Перед использованием разводят в 10 частях деионизированной или бидистиллированной воды;

стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 М раствор серной кислоты;

бидистиллированная вода.

Примечание.

Оборудование: микропланшетный иммуноферментный анализатор Рах-2100, настраиваемый на длину волны 450 нм и перенастраиваемый на 600 и 620 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) Рах-2200, настраиваемый на 500—700 движений/мин; автоматическое промывающее устройство Рах-2600; полуавтоматические пипетки на 50 и 100 мкл, наконечники; градуированная лабораторная посуда, полистириновые пробирки; фильтровальная бумага для просушивания стрипов; миллиметровая бумага для построения калибровочного графика (при отсутствии программного обеспечения).

Подготовка реагентов к анализу. 1. Антител-энзимный конъ- югатный раствор: антител-энзимный конъюгатный концентрат развести в аналитическом буфере (1 : 50), исходя из числа используемых ячеек (при использовании плашки на 96 ячеек 220 мкл конъюгатного концентрата разводят в 11 мл аналитического буфера). Разводят его непосредственно перед исследованием.

2. Моющий раствор: 100 мл моющего концентрата растворить в 900 мл бидистиллированной воды. Раствор стабилен при комнатной температуре в посуде из темного стекла в течение 1 мес.
3. Микротитрационные ячейки: отобрать для исследования необходимое количество стрипов, а остальные стрипы поместить в защитный влагонепроницаемый пакет с десикантом.

Ход определения. Перед использованием все реагенты и пробы должны быть приведены к комнатной температуре (~ 25 °С).

Образцы сыворотки крови, стандарты и контроли необходимо исследовать в параллельных пробах.

В используемые ячейки микротитрационных стрипов пипеткой вносят по 50 мкл стандартов, контролей и исследуемой сыворотки крови.

По окончании инкубации в каждую ячейку пипеткой добавляют по 100 мкл стоп-раствора (0,2 М раствор серной кислоты) для прерывания реакции и развития окрашивания. Помещают плашку со стрипами в иммуноферментный анализатор (ридер) для измерения абсорбции раствора в ячейках при длине волны 450 нм (в течение 30 мин после добавления стоп-раствора). Перед учетом абсорбции микротитрационных ячеек необходимо установить прибор на «0» в соответствии с нулевым стандартом (Blanc). При возможности для более точного измерения абсорбции необходимо установить прибор на измерение двойного излучения при длине волны 450 нм с последующей перенастройкой на 600 или 620 нм.

Полученные значения стандартов ТТГ используют для построения стандартной кривой, по которой определяют концентрацию тиреотропина в исследуемых образцах.

Примечание. Все стандартные растворы приведены в мкМЕ/мл.

Для перевода в мМЕ/л необходимо мкМЕ/мл х х 1,0 = мМЕ/л.

Клиническое значение. ТТГ секретируется аденогипофизом. Он стимулирует поглощение щитовидной железой йодида из крови, усиливает синтез тиреоглобулина и его распад с высвобождением Тз и Т4 в кровь. Секреция тиреоидных гормонов после выделения ТТГ возрастает уже через несколько минут.

ТТГ является маркером при оценке функционального состояния щитовидной железы. В основе регуляции секреции ТТГ лежит механизм обратной связи: высокие концентрации Т3 и Т4 ингибируют, а низкие стимулируют секрецию ТТГ.

При гипертиреозе синтез и секреция ТТГ в гипофизе по принципу обратной связи блокированы высокими уровнями Т3 и Т4: количество ТТГ в крови менее 0,2 мИЕ/мл или гормон в крови не определяются. Введение Т3 быстро снижает концентрацию ТТГ. Аналогичное действие оказывает и Т4, но для этого требуется доза в 10 раз больше, чем Т3, а торможение длится в 10 раз дольше.