Конъюгаты и субстраты

В иммуноферментном анализе ферментную метку вводят в молекулу антитела или антигена. В ELISA детектирующими молекулами являются конъюгаты антител с ферментами. Для приготовления конъюгатов наиболее часто используют пероксидазу хрена (ПХ; horseradish peroxidase — HRPO) или щелочную фосфатазу (alkaline phosphatase — АР).

Ковалентное связывание этих ферментов с иммуноглобулинами осуществляют с помощью глютаральдегида, если используют щелочную фосфатазу, или перио- датного окисления в случае ПХ. Присоединение щелочной фосфатазы к антителу глютаральдегидом происходит в одну стадию. Пероксидазные

62 конъюгаты получают окисляя фермент перйодатом натрия. Альдегидные группы углеводного участка ПХ, образовавшиеся в результате этой реакции, реагируют с аминокислотными остатками иммуноглобулинов.
Субстратами для пероксидазных конъюгатов служат о-фенилендиа- мин и перекись водорода. Окрашенный продукт реакции имеет максимум поглощения при 492 нм. Субстратом щелочной фосфатазы является р-нит- рофенилфосфат, он превращается /7-нитрофенол, который измеряют при 405 нм.
Помимо конъюгатов с пероксидазой хрена и щелочной фосфатазой для диагностики фитопатогенов получают конъюгаты и с другими ферментами. Например, для обнаружения вирусов растений применяют конъюгаты с неорганической пирофосфатазой и пенициллиназой.
При детекции патогенов в растительных тканях предпочтительнее использовать конъюгаты антител со щелочной фосфатазой, так как данный фермент, в отличие от пероксидазы, не встречается в высших растениях. Это позволяет снизить вероятность получения ложноположительных результатов при анализе растительного сока или экстракта. Тем не менее, анализ патогенов в растительных образцах очень часто проводят с помощью антител, меченных ПХ, поскольку данный фермент отличается высокой удельной активностью, стабильностью и небольшим размером (отсутствуют пространственные ограничения при конъюгировании с антителом). Важной характеристикой конъюгатов антител с ПХ является показатель RZ (Reinheitszahl), который рассчитывают, определяя отношение поглощения конъюгата при 403 нм к его поглощению при 278 нм. В конечном счете, RZ показывает, какая доля антител, подвергшихся конъюги- рованию, действительно несет ферментную метку.

У конъюгатов с достаточным содержанием меченых антител этот показатель должен составлять 0,3-0,4. Обычно, готовые для анализов конъюгаты после добавления равного объема глицерина хранят при -20 °С.
Чувствительность ELISA можно сделать еще более высокой, используя систему «стрептавидин—биотин» (или «авидин—биотин») или конъюгаты с люциферазой и флуоресцирующий субстрат люциферин (люминесцентный или флуоресцентный ELISA). Диагностические возможности ELISA значительно возросли после разработки его мультиплексного варианта. Мультиплексный (множественный, или сложный) анализ (multiple assay) применяют, когда в образце, внесенном в одну лунку планшета, необходимо одновременно обнаружить несколько видов фитопатогенов.
Твердые фазы
Чаще всего для осуществления ELISA применяют полистирольные 96-луночные планшеты, так как полистирол легко адсорбирует антитела и различные антигены. К тому же в распоряжении исследователей имеется целый ряд химических методов обработки планшетов, в результате которых на их поверхности остаются реакционно-способные функциональные группы (например, гидразин или имид малеиновой кислоты), способные

ковалентно связывать антитела и антигены. Для того, чтобы усилить спо- 63 собность полистирола абсорбировать антитела и другие белки, лунки обрабатывают 1 % нитроцеллюлозой. Дополнительным эффектом такой обработки является более равномерная абсорбция молекул. Все эти процедуры специальной подготовки планшетов из полистирола повышают эффективность ELISA. В качестве твердой фазы в одном из вариантов ИФА, так называемом дот-ELISA, для иммобилизации как антигенов, так и антител используют нитроцеллюлозные мембраны. В этом случае предпочтительнее использовать субстраты, в результате расщепления которых на мембране образуется нерастворимый продукт ферментативной реакции. Твердыми носителями также могут служить магнитные шарики или частицы, покрытые полистиролом. Применение мембран или магнитных частиц обычно упрощает и ускоряет процедуру анализа, делая его более пригодным для полевых условий.

Еще по теме Конъюгаты и субстраты:

1.   Определение диеновых конъюгатов и кетодиенов полиненасы- щениых жирных кислот в крови. 
2. Почва и субстрат вообще.
3. ТОРФ КАК СУБСТРАТ ДЛЯ РАСТЕНИЙ
4. 3.2. ИСТОРИЯ ФОРМИРОВАНИЯ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ ОБ ОРГАНИЗАЦИИ МАТЕРИАЛЬНОГО СУБСТРАТА НАСЛЕДСТВЕННОСТИ И ИЗМЕНЧИВОСТИ
5.   Определение активности креатинкииазы (КК) в сыворотке (плазме) крови с использованием креатинфосфата в качестве субстрата. 
6.   Определение активности а-амилазы в сыворотке крови, моче, дуоденальном содержимом амилоклассическим методом со стойким крахмальным субстратом (метод Каравея).  
7.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОГЕСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC AUTOMATION INC., США)  
8.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕСТОСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTICAUTOMATIONINC., США)  
9.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭСТРАДИОЛА В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC AUTOMATION INC., США)  
10. Сульфатная конъюгация. 
11.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАТИРЕОИДНОГО ГОРМОНА (ПТГ) В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  
12. Вторая фаза метаболизма ксенобиотиков (реакции синтеза и конъюгации). 
13.   9.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИЙОДТИРОНИНА (Т3) В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США) 
14. Ацетилирование. 
15.   Определение активности у-глутамилтранспептидазы (у-глута- милтрансферазы) в сыворотке крови с помощью набора реактивов.  
16. Сообщества морских макрофитов[‡‡‡‡‡]
17. Разложение сложных органическихбезазотных веществ
18. Рекультивация нарушенных земель
19. Афлатоксины
20. Фильтраторы эпифауны твёрдых грунтов