Разложение сложных органическихбезазотных веществ

Первыми деструкторами полимеров могут выступать лишь те микроорганизмы, которые обладают гидролитическими ферментами, за что они и получили название гидролитиков (рис. 72). Гидролиз проводится внеклеточно, так как полимеры не могут проникнуть внутрь клетки. Образуются мономеры или короткие цепочки мономеров (часто димеры), которые для дальнейшего использования в энергетических или конструктивных целях обязательно должны попасть внутрь клетки, т.е. преодолеть цитоплазматическую мембрану, что обычно осуществляется с помощью специфичных для каждого субстрата переносчиков — пермеаз. Перенос питательных веществ через плазматическую мембрану, как правило, специфичен. Поглощаться могут только те вещества, для которых имеются соответствующие транспортные системы. Это мембранные белки похожие на ферменты (индуцируются субстратом, специфичны в отношении субстрата), но не всегда изменяют субстрат. Полимер, прежде чем попасть в клетку, должен гидролизоваться. В аэробной зоне такими очень активными микробами-гидролитиками являются грибы и многие бактерии, особенно актиномицеты. В анаэробной зоне гид- ролитики представлены бактериями, хотя в последнее время выделены и анаэробные грибы. Большое значение они имеют при гидролизе целлюлозы в рубце жвачных животных. Гидролитические ферменты, выделяемые этими микроорганизмами во внешнюю среду, накапливаются в почве, адсорбируются на почвенных частицах и образуют пул иммобилизованных ферментов — тот запас или резерв, который продолжает свою работу в течение долгого времени и отличается устойчивостью к неблагоприятным факторам (продолжительное хранение, высушивание, изменение температуры).

Рис. 72. Схема микробного разложения полимеров в аэробной и анаэробной зонах (ЖК — жирные кислоты)

Превращения полимеров при доступе кислорода происходят глубоко, до освобождения С02, и лишь небольшая часть продуктов распада попадает «в зону рассеяния», где олиготрофные микроорганизмы аэробной зоны заканчивают переработку этих продуктов, собирая их из среды, где они рассеяны в низкой концентрации. Такие олиготрофные микроорганизмы представлены грамотрицательными бактериями, среди которых значительную долю составляют простекобактерии и гифомикробы.

В анаэробных условиях в процессе первичного разложения органических веществ в качестве продуктов распада образуются жирные кислоты и молекулярный водород, который мигрирует в аэробную зону, где подвергается окислению водородными бактериями, а также включается в метаболические пути других бактерий. Часть водорода в анаэробной зоне используется вторичными анаэробами, например метаногенными бактериями, восстанавливающими С02 до метана, который тоже мигрирует в окислительную зону и там улавливается метанокисляющими бактериями. Жирные кислоты поступают к вторичным анаэробам, например сульфатредуцируюшим и денитрифицирующим бактериям, которые используют их как источники углерода и энергии при восстановлении неорганических акцепторов электрона, таких как сульфаты или нитраты.

Часть продуктов разложения органических веществ анаэробной зоны попадает к микрофлоре рассеяния шли олиготрофам — анаэробам.

Рассмотрим пути и способы переработки микроорганизмами отдельных групп полимерных веществ растительного происхождения в почве. />Крахмал — запасной полисахарид растений, который накапливается главным образом в семенах, корневищах, луковицах и клубнях, где его содержание может достигать 70-80%.

Рис. 73. Деструкция крахмала (амилозы и амилопектина) ферментами

цепью, скрученный витками, в нативном состоянии — по три молекулы глюкозы в каждом, в растворе — по шесть молекул. На долю амилозы в крахмале приходится 20-25%, а на долю амилопектина — 75-80%. Амилоза растворима только в горячей воде. При реакции с йодом она дает синее окрашивание. Эта реакция используется для определения у микроорганизмов амилолитической активности (по исчезновению окраски). Амилопектин окрашивается от йода в красно-фиолетовый цвет. Это разветвленный полимер с высокой молекулярной массой. Молекула амилопектина — одна из самых крупных органических молекул. Он растворяется в воде лишь при нагревании и дает очень вязкие растворы. Амилопектины разных растений различаются по степени разветвленности, по длине цепей и молекулярной массе. Крахмал разлагается внеклеточными микробными ферментами, которые носят общее название амилаз (от названия субстрата амилоза). Они рас- щепля ют крахмал с образованием декстринов, мальтозы, мальто- триозы и глюкозы. Существует несколько амилаз, которые различаются по месту воздействия на молекулу амилозы и амилопекти- на (место расположения химической связи). Например, а-амилаза разрывает внутренние связи в молекуле амилопектина, и поэтому ее называют еще эндоамилазой. В результате образуется много декстринов и немного мальтозы и глюкозы (рис. 73). Глюкоамилаза расщепляет крахмал до глюкозы. В природе продукты расщепления крахмала в аэробных условиях быстро используются самими гидролитиками и сопутствующими микроорганизмами и процесс заканчивается выделением С02. В анаэробных условиях мальтоза и глюкоза сбраживаются с образованием органических кислот, спиртов и газов (рис.

Пектины в растениях образуют межклеточное вещество, из которого состоят так называемые срединные пластинки, соединяющие между собой отдельные клетки. Они придают растительным тканям прочность. Особенно много пектина в ягодах и плодах. В антоновских яблоках, например, содержание пектина достигает 30%. Свое название пектины (от греч. pektos — студень) получили благодаря способности образовывать гель.

В химическом отношении пектины — это кислые полисахариды, неразветвленные полимеры галактуроновой кислоты, карбоксильные группы которой полностью или частично этерифи- цированы метанолом. Часто они имеют также боковые цепи из моносахаров. Пектиновые вещества — это смесь нерастворимого в воде протопектина, растворимого пектина, слабо или полностью неэтерифицированных пектиновой и пектовой кислот и их солей. На разные формы пектиновых веществ действуют различные ферменты микроорганизмов. Протопектиназы переводят нерастворимый протопектин в растворимые формы; пектинэсте- разы разрывают эфирные связи, в результате чего образуется метанол и свободные пектиновые кислоты; полигалактуроназы разлагают цепь пектина на молекулы D-галактуроновой кислоты.

Рис. 74. Схема разложения крахмала в аэробных и анаэробных условиях

Пектины разлагаются очень многими почвенными микроорганизмами, а также некоторыми фитопатогенными грибами и бактериями, которые проникают в ткань растений и вызывают болезни. Микробиологические процессы разложения пектина лежат в основе обработки лубяных растений (льна, конопли) для получения прядильного волокна. В кустарных производствах широко известны росяная и водяная мочка. Росяную мочку проводят методом расстила; она проходит на поверхности почвы в аэробных условиях, и лубяные волокна (треста) высвобождаются из стебля благодаря деятельности грибов, которые растворяют пектины стеблевой коровой паренхимы.

Водяная мочка заключается в погружении снопов растений на дно водоема. Здесь в анаэробных условиях процесс разложения пектина осуществляют анаэробные маслянокислые бактерии Clostridium felsineum.

Пектинолитические ферменты, получаемые из почвенных микроорганизмов, широко применяются в технологических процессах при производстве продуктов из плодов и овощей. Например, для осветления фруктовых соков используют фермент из Penicilllium frequentans. Ферментные препараты пектиназ внедряются в производство льняного волокна.

Целлюлоза — наиболее распространенное органическое соединение в природе, по масштабам ее синтез занимает первое место. Целлюлозу в основном создают высшие растения, которые на 40-70% состоят из целлюлозы. В хлопке и льне содержание целлюлозы достигает 80-95%. Очень немногие грибы (например, представители класса Oomycetes) и редкие виды бактерий (уксуснокислые Gluconacetobacter xylinum, Acetobacter xylinum, клубеньковые бактерии) тоже синтезируют целлюлозу. Синтез целлюлозы растениями сопряжен с ее разложением микроорганизмами. Разложение целлюлозы — едва ли не самый большой по масштабам естественный деструкционный процесс. Именно в этом звене круговорота углерода почвенные микроорганизмы выступают как геохимические агенты, обеспечивающие возврат углерода в атмосферу в виде С02. В этом заключается основное, но не единственное значение микробного разложения целлюлозы. С этим процессом связано образование в почве гумусовых веществ и формирование почвенной структуры. Особенно важно подчеркнуть участие в этом процессе микроорганизмов, поскольку ни животные, ни растения не способны разлагать целлюлозу.

Очень редко способность разлагать целлюлозу обнаруживается у беспозвоночных животных: термитов, некоторых моллюсков (например, виноградной улитки), корабельного червя, личинок жуков ит.д., но вероятнее всего целлюлозу разлагают микроорганизмы-симбионты, находящиеся в кишечном тракте.

Целлюлоза представляет собой линейный гомополисахарид, состоящий из глюкозных единиц. Молекулярная масса до 500 тыс. В одной молекуле целлюлозы до 14 тыс. молекул ()-/)-глюкозы. Целлюлозные волокна включают микрофибриллы и мицеллы (кристаллиты) — плотно упакованные цепи макромолекул, чередующиеся с аморфными участками. Наличием этих участков в структуре целлюлозы объясняется ее набухаемость и некоторые другие свойства, отличающие целлюлозу от истинно кристаллических структур. Эти участки в первую очередь подвергаются ферментативному гидролизу. Разложение целлюлозы до глюкозы микробными ферментными препаратами протекает в несколько стадий и требует участия сложного комплекса ферментов (рис. 75). В качестве продуцентов полиферментных целлюлозных комплексов используют грибы Geotrichum candidum, Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, T. viride и др. Это направление имеет большие перспективы в биотехнологии, однако промышленный процесс получения глюкозы из целлюлозы ферментативным путем пока не реализован ни в одной стране из-за его дороговизны.

Рис. 75. Ферментативный гидролиз целлюлозы

В природе разложение целлюлозы — сложный и комплексный процесс. Он совершается, по-видимому, при участии сообществ микроорганизмов, в которых есть основной компонент, разлагающий молекулы целлюлозы, и микроорганизмы-спутники, использующие продукты распада. Некоторые базидиальные грибы имеют полный комплекс целлюлолитических и лигнинолитических ферментов.

Изучение процессов разложения клетчатки в природе было начато еще в XIX в. под влиянием идей Луи Пастера об анаэробных брожениях. Поэтому в первую очередь изучали анаэробное разложение целлюлозы. Академик В.Л. Омелянский подробно изучил анаэробный распад клетчатки и выделил возбудителей этого процесса, один из которых впоследствии был назван в его честь Clostridium omelianskii. Это тонкие, длиной до 12 мкм, слегка изогнутые палочки с округлыми или овальными терминальными спорами («барабанные палочки»).

При анаэробном разложении целлюлозы образуется много органических кислот (уксусная, янтарная, молочная, масляная, муравьиная), этиловый спирт, углекислый газ и водород. Поэтому анаэробное разложение целлюлозы сопровождается активным развитием сопутствующих микроорганизмов, часто азотфиксато- ров, хотя и сами клостридии способны фиксировать азот. Сбраживание клетчатки происходит в природе и при повышенных температурах, например при разогревании торфа, соломы, ком- постов. В этом случае возбудители процесса — термофильные бактерии Clostridium thermoceiium. Выделенный из горячих источников анаэроб Thermoanaerobacter ethanolicus при сбраживании клетчатки образует большое количество этанола. Культивирование термофилов дает возможность из целлюлозного сырья получать этиловый спирт путем экономичной ферментации при высоких температурах. Другая термофильная бактерия Thermoanaerobium brockii не использует целлюлозу, но хорошо растет на целлобиозе, также продуцируя этанол. Этот микроорганизм выделяется из горячих источников вулканического происхождения и имеет температурный диапазон роста между 35 и 85 °С с оптимумом 65-70 °С.

В отличие от процесса анаэробного разложения целлюлозы, который осуществляется бактериями и специфическими грибами рубца, а вероятно, и некоторыми почвенными грибами, в аэробных условиях клетчатку разлагают многие микроорганизмы разных систематических групп: грибы, актиномицеты, миксобактерии и др.

В кислых лесных почвах, где клетчатка в значительных количествах входит в состав мертвой древесины, она более доступна для грибного разложения, особенно в связи с тем, что тесно связана с лигнином, а главными лигниноразлагателями являются грибы. Среди них наиболее активны такие типичные подстилочные сапротрофы, как Trichoderma viride, Chaetomium globosum, Myrothecium verrucaria, а также некоторые виды родов Dicoccum, Stachybotrys, Penicillium и Aspergillus. Характерная особенность грибного разложения целлюлозы — выделение целлюлазных ферментов в окружающую среду. Они выбрасывают ферменты и только часть образовавшихся мономеров поступает в гифы гриба. Часть мономеров используется микробами, которые не образуют собственных гидролаз. Полагают, что многие из них являются бактериями азотфиксаторами и часть фиксированного азота отдают грибам, таким образом между этими организмами устанавливается протокооперация.

Целлюлазы бактерий связаны с клеточной поверхностью. Они находятся в целлюлосомах и прикрепление клеток к волокнам целлюлозы через ферменты является обязательным условием ее использования. Бактерии продукты гидролиза используют более полно по сравнению с грибами.

В почвах под травянистой растительностью в степных и луговых ландшафтах в разложении целлюлозы помимо грибов в большей степени участвуют миксобактерии, цитофаги, актиномицеты и другие бактерии, хотя грибы во всех зонах играют главенствующую роль.

Вибрионы рода Cellvibrio исключительно широко распространены в разных почвах, но больше их в почвах под лугом, чем под лесом. Они быстро воздействуют на клетчатку, вызывая ее частичное разложение, а не полный лизис, как в случае с мик- собактериями.

Актиномицеты родов Nocardia, Streptomyces, Streptosporangium разлагают целлюлозу медленнее, чем грибы. Они выступают агентами этого процесса в южных почвах — каштановых и сероземах.

Ксиланы (гем и целлюлозы) — это опорные вещества в растениях. Они входят в состав древесины. Ксилан (полимер ксилозы) по количеству занимает второе место после целлюлозы. В соломе злаковых его содержится 20%, в древесине хвойных — 12, лиственных — до 25%. Помимо растений ксиланы имеются у грибов и дрожжей в составе их внеклеточных полисахаридов. Это полимеры сахаров и уроновых кислот. Из сахаров в состав микробных ксиланов входят гексозы и пентозы. Например, полисахариды, из которых состоит капсула почвенных дрожжей рода Lipomyces, имеют в основной цепи повторяющиеся звенья из глю- куроновой кислоты и маннозы, а в боковых цепях— галактозу; внеклеточные полисахариды других дрожжей — рода Cryptococcus содержат глюкуроновую кислоту, маннозу и ксилозу. Разложение ксиланов может осуществляться разными почвенными микроорганизмами: грибами, бактериями и актиномицетами. Кси- ланаза — внеклеточный фермент, он есть у многих грибов и некоторых дрожжей, как, например, у обитателей лесной подстилки — дрожжей рода Trichosporon. На ксилане активно растут шампиньоны. Ксиланазу образуют и многие целлюлозоразрушающие бактерии.

Липиды (жиры) входят в состав растительных и животных тканей. Некоторые органы растений, например семена, бывают очень богаты жирами. В почве, обогащенной гумусом и растительными остатками, фракция жиров, экстрагируемая органическими растворителями, может составлять 3-5%. В почве жиры разлагаются микроорганизмами, обладающими ферментами липазами. При разложении жиров образуются глицерин и жирные кислоты. В аэробных условиях глицерин быстро используется в метаболизме многих бактерий и грибов, а жирные кислоты более стойкие, иногда они накапливаются в почве и обусловливают ее токсичность. В анаэробных условиях жирные кислоты восстанавливаются до углеводородов. Липазы имеются у всех почвенных организмов (аэробов и анаэробов): грибов, бактерий и актиномицетов.

Углеводороды в почве представлены газообразными (метан, этан, пропан, этилен и др.), жидкими и твердыми веществами; они могут быть алифатическими и циклическими соединениями. Метан образуется в почве в результате метанового брожения. Однако газообразные углеводороды, такие как метан, пропан, могут поступать в почву из нижележащих слоев. Их повышенная концентрация в почве и особенно в подпочвенных горизонтах соответствует газовым месторождениям. В таких почвах наблюдается высокая численность углеводородокисляющих микроорганизмов — биологических агентов, окисляющих углеводороды. На определении этих бактерий в почве и подпочвенных слоях основаны методы биологической разведки газовых и нефтяных месторождений (Могилевский, Оборин).

Алифатические углеводороды с цепью длиной [С,2—С,8] окисляются многими бактериями, грибами и дрожжами. Наиболее активны в процессах использования углеводородов представители группы коринеподобных бактерий, псевдомонады и нокар- дии, из дрожжей — виды родов Candida, Debaryomyces, Schwannio- myces. Большое значение имеет длина углеродной цепи: быстрее используются углеводороды начиная с гексадекана (С16). Утилизация углеводородов происходит в окислительных условиях, так как первый этап воздействия на углеводородную цепь — окисление концевого углерода ферментами оксигеназами. Дальнейшее окисление протекает по пути, который известен как р-окисление жирных кислот. При низком парциальном давлении кислорода происходит накопление промежуточных продуктов окисления углеводородов — жирных кислот начиная с С3 — пропионовой кислоты.

Разложение микроорганизмами ароматических углеводородов в почве имеет очень большое значение в круговороте углерода. Способность разлагать ароматические углеводороды присуща многим грибам и аэробным бактериям. Из бактерий наиболее активны представители родов Pseudomonas и Arthrobacter. Разложение циклических углеводородов начинается с гидроксилиро- вания — включения в них оксигрупп и перевода их в орто- или пара-диоксифенилпроизводные. Далее следует разрыв кольца под действием оксигеназ, катализирующих окисление субстрата кислородом. Боковые цепи и заместители отщепляются, как правило, до разрыва кольца. Разрыв ароматического кольца происходит разными путями у разных микроорганизмов. Из почв были выделены бактерии, разлагающие полициклические соединения углеводородной природы — нафталин, антрацен, фенантрен и др. Промежуточным продуктом их распада является салициловая кислота.

Итак, большинство углеводородов окисляется микроорганизмами. Этот процесс важен в аспекте самоочищения почвы от загрязнений нефтью и продуктами ее переработки. В настоящее время предлагается много коммерческих препаратов на микробной основе для уничтожения нефтяных загрязнений почв. Однако эффективность их не так высока: необходимо вносить очень большое количество микробной биомассы и создавать благоприятные условия для роста микроорганизмов (обычно бактерий). Особенно медленно идет очистка почвы от нефти в холодном климате. В настоящее время огромные площади почв загрязнены нефтью из скважин и разрывов нефтепроводов. Очиститься от нефти они могут только через сотни лет. Для ускорения очистки необходимо применять следующие мероприятия: 1) повышение аэрации, например простая вспашка почв, для окисления углеводородов необходим кислород, 2) добавление минеральных удобрений в том числе и микроэлементов, 3) внесение поверхностно-активных веществ (ПАВ), увеличивающих площадь соприкосновения микроорганизмов с нефтепродуктами, 4) внесение легкоразлагаемых веществ (косубстратов), например органических удобрений, способствующих разложению труднодоступных веществ, 5) фитомелиорация с подбором специфических видов растений, 6) внесение нефтеразлагающих микроорганизмов. Внесение микроорганизмов стоит на последнем месте, так как в любой почве все эти микроорганизмы имеются, однако массированное внесение (тонны на 1 га) может существенно ускорить процесс. В дальнейшем, вероятно, с успехом будут применяться генно-инженерные штаммы. Быстрая мелиорация нефтезагрязненных почв даже в условиях теплого и влажного климата является очень дорогим мероприятием (100 тыс. руб. на 1 га).

Метан — это особый углеводород. Его потребляют специфические группы бактерий, не способные использовать другие углеводороды. Их относят к бактериям, утилизирующим одноуглеродные соединения. Они характеризуются рядом особенностей строения, спецификой биохимии и физиологии. В настоящее время описано 12 родов облигатных метанотрофных бактерий, способных непосредственно окислять метан, а также другие одноуглеродные соединения (метанол, метилированные амины, диметиловый эфир, формальдегид и формиат). Ранее их называли метилотрофными микроорганизмами, что повлияло на их названия: Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylosinus, Methylocystis, Methylovorus, Methylovibrio, Methylomicrobium и другие, т.е. они делятся на роды по морфологии клеток. Окисление метана в метанол сопровождается включением в молекулу одного атома кислорода, эту реакцию катализирует метаноксигеназа:

СН4 + 02 -»СН3ОН -gt; НСНО -» НСООН -gt; С02 + 4Н.

Вещество клеток синтезируется из формальдегида.

Образование метана осуществляется метаногенами в анаэробных условиях. В оструктуренных почвах метан образуется внутри агрегатов, но окисляется на их поверхности и таким образом не происходит бесполезной потери энергонесущего вещества из экосистемы. Делаются попытки использовать метанотрофы для борьбы с метаном в шахтах. Много шахтеров гибнет из-за взрывов метана. В принципе метан можно использовать для получения микробной массы и ряда микробных физиологически активных веществ.

Лигнин (от лат. lignum — дерево, древесина) синтезируется высшими растениями и в количественном отношении уступает только целлюлозе и ксиланам. В древесине лиственных пород деревьев лигнина содержится 18-25%, хвойных — до 30%. В растительном организме это вещество выполняет только механические функции: оно относится к инкрустирующим веществам клеточной стенки. Лигнин вызывает одревеснение клеток и придает им большую прочность. Если целлюлозные микрофибриллы сравнить с арматурой железобетонных конструкций, то лигнину следует отвести роль бетона. Химическое строение лигнина окончательно не установлено. Известно, что в разных растениях он неоднороден. Сложность структуры определяется большим числом полимеризованных мономерных блоков, которые представляют собой производные фенилпропана. Основной мономер лигнина — конифериловый спирт; он составляет главную часть лигнина хвойных. В лигнине лиственных пород есть еще синапо- вый спирт, а в лигнине из соломы злаков — кумаровый спирт:

Лигнин не растворяется ни в воде, ни в органических растворителях, но растворяется в щелочи, извлекается из древесины диоксаном, дает цветные реакции, характерные для фенолов. Микробные ферменты лигниназы — сложный комплекс различных ферментов. К ним относятся специфические пероксидазы, удаляющие электрон от арильных колец. Процесс разложения лигнина в природе протекает очень медленно, поэтому промежуточные продукты накапливаются в почве, а также и сам лигнин.

Основные деструкторы лигнина — базидиальные грибы. Некоторые из них разрушают лигнин даже в живых растениях,

например осенний опенок Armillaria mellea. Древоразрушающие базидиомицеты, вызывающие белую гниль древесины, — наиболее активные разрушители лигнина вместе с некоторыми подстилочными сапротрофами. Можно проследить сукцессию видов при разложении лигнина. Процесс начинается еще в растущем дереве, на котором поселяются базидиомицеты — паразиты родов Forties, Polyporus, Armillaria и др. На мертвой древесине появляется другая группировка грибов — это Ceratostomella, Cladosporium. Далее частично разрушенную древесину заселяют подстилочные сапротрофы родов Collybia, Marasmius, Мусепа, и, наконец, в поздней стадии происходит колонизация остатков почвенными грибами из группы несовершенных: Fusarium, Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Rhizoctonia. На более поздних стадиях в разложении лигнина участвуют и бактерии, причем только грамотрицатель- ные. Древесина и опад лиственных деревьев разрушаются быстрее, чем хвойных.

Разрушающаяся под действием грибов древесина активно заселяется азотфиксирующими бактериями. Разложение лигнина идет обычно параллельно с распадом целлюлозы, причем оба эти процесса могут вызывать одни и те же организмы. Например, у Polyporus abietinus найдено до 20 внеклеточных ферментов, среди которых есть и целлюлазы, и ферменты, разлагающие лигнин, и кроме того, ферментативный комплекс, воздействующий на пектины, крахмал, ксиланы. Несомненно, что в природе разложение лигнина совершается сложным комплексом микроорганизмов и высших грибов, и этот процесс идет значительно интенсивнее, чем при лабораторных анализах с чистыми культурами. Способность грибов расти на лигнинсодержащем субстрате используется на практике при культивировании ценного съедобного гриба вешенки обыкновенной Pleurotus ostreatus на кусках осиновой древесины.