Основные варианты ELISA, применяющиеся в фитопатологии

Теоретические аспекты иммуноферментного анализа, в частности, его физико-химические основы, а также принципы классификации его различных модификаций подробно изложены в ряде руководств, в частности в книге «Теория и практика иммуноферментного анализа» (Егоров и др., 1991).

В данном разделе мы лишь вкратце воспроизведем классификацию ИФА и рассмотрим как вариант данного метода твердофазный иммуно- ферментный анализ — ELISA, который получил наибольшее признание в диагностической фитопатологии.
Та или иная разновидность ИФА может быть отнесена к гомогенным или гетерогенным, в зависимости от того, где происходит специфическое взаимодействие «антиген — антитело». При гомогенном анализе, все стадии, включая ферментативную реакцию, происходят в растворе. Детекция антигенов или их количественное измерение проводится без разделения взаимодействующих и невзаимодействующих компонентов иммунологической реакции. Гетерогенный вариант анализа предполагает разделение свободного и иммунохимически связанного иммунореагента (антигена, антитела) на твердой фазе с помощью иммобилизованных на ней комплементарных реагентов (соответственно, антитела и антигена). Одновременно не связавшиеся антитела, антигены или конъюгаты, а также возможные ингибиторы реакции и другие вещества, присутствие которых нежелательно, удаляются из реакционной системы отмыванием. Гомогенный анализ обычно используют для низкомолекулярных соединений, например, для обнаружения и определения количества таких гаптенов, как токсины, гормоны, лекарственные вещества и т. п. Сфера его применения для диагностических целей в фитопатологии, по сравнению с гетерогенным вариантом, довольно ограничена. Детекцию по гаптенам осуществляют, например, в ELISA микотоксинов. При получении антисывороток со специфичностью к микотоксинам обычно синтезируют два конъюгата с двумя различными белками, затем один из них используют для иммунизации, а
64 конъюгат со вторым белком — непосредственно при анализе. Это позволяет избежать абсорбции антисыворотки первым белком, которая, в противном случае, будет нужна, чтобы убрать антитела со специфичностью к его детерминантам.
Среди вариантов EL1SA различают конкурентные и неконкурентные. Отличительными чертами конкурентного варианта является одновременное присутствие на первой стадии анализа антигена из анализируемого образца и меченого антигена, а также их конкуренция за соединение с ограниченным числом сайтов связывания на антителах. Конкурентный ELISA применяется для диагностики фитопатогенов, но не является широко распространенным, поскольку в качестве иммуногенов в фитопатологии часто используют не индивидуальные антигены, в которые можно ввести метку, а их смеси или просто экстракты. ELISA называют прямым или непрямым в зависимости от типа антитела, маркированного ферментом. В прямом варианте метода определяемый антиген обнаруживают конъюгатом гомологичных (полученных к данному антигену и специфичных к нему) антител. В непрямом ELISA для связывания целевого антигена используют немеченые гомологичные антитела (ABsi), а затем образовавшийся комплекс «антиген — антитело» детектирую с помощью ферментных конъюгатов других (вторичных, или антивидовых) антител, которые получены против ABsi. Наконец, различают варианты ELISA в зависимости от типа фермента и субстрата (колориметрический, флуориметрический, биолюминесцентный ELISA) или от способа измерения ферментативной активности. Разнообразие модификаций ELISA — главным образом результат комбинаций основных, описанных выше, вариантов, а также того, какой из иммунореагентов (антиген или антитело) иммобилизуют на твердой фазе.
Основные области использования ELISA в фитопатологии — детекция и количественное определение патогенов в растениях, почве или других образцах, выявление инфицированных растений до появления симптомов заболевания, а так же отбор здоровых семян или посевного материала. Весьма распространенным вариантом анализа в этих областях является сэндвич- ELISA, в котором на твердой фазе иммобилизуют антитела (Double Antibody Sandwich-ELISA— DAS-ELISA).
По существу, сэндвич-вариант (рис. 3.2) с использованием полисти- рольных планшетов представляет собой последовательность следующих процедур: Внесение антител специфичных к фитопатогену в лунки планшета. Инкубация планшета, во время которой антитела абсорбируются на полистироле, с последующей промывкой, которая удаляет несорбиро- ванные антитела. Внесение в лунки раствора какого-либо белка, не вступающего в реакцию с иммунореагентами и ферментом, чтобы блокировать участки неспецифического связывания на полистироле. Добавление образца, из которого иммобилизованные антитела захватывают и связывают определяемый антиген (антигены).

Инкубация планшета, во время которой происходит взаимодействие этих иммунореагентов, и его отмывка, чтобы удалить неспецифичные компоненты. Добавление специфичных для определяемого фитопатогена антител меченых или не меченых ферментом.
Если на этой стадии используют антитела с ферментной меткой (конъюгаты), то далее следуют стадия 7. Если на стадии 6 в реакцию вводят немеченые антиген-специфичные антитела, проводится дополнительная стадия 6а.
6а. Добавление конъюгатов антивидовых антител (например, если антитела, специфичные к фитопатогену, были получены из антисыворотки

66 иммунизированных кроликов, добавляют меченые ферментом анти
тела мыши против иммуноглобулинов кролика). Инкубация планшета и промывание, чтобы удалить несвязавшийся конъюгат. Добавление субстрата фермента с последующей кратковременной или более длительной инкубацией, во время которой развивается окрашивание. Торможение ферментативной реакции. Регистрация результатов анализа визуально или измерение поглощения инструментально.
Фактически, приведенный выше протокол объединяет два общепринятых формата ELISA, хорошо известные как прямой и непрямой сэндвич- ELISA. Непрямой сэндвич-вариант часто встречается в литературе под названием TAS-ELISA (Triple Antibody Sandwich-ELISA). Как уже отмечалось, в нем используют антитела двух различных видов животных. Антитела, специфичные к целевому антигену, получают от одного вида, а конъюгаты синтезируют с антителами, выделенными из антисыворотки другого вида против константных детерминант иммуноглобулинов (IgG) животных первого вида. Вместо вторичных (антивидовых) конъюгатов часто можно использовать конъюгаты ферментов с имеющим сродство к иммуноглобулинам белком А из стафилококка. При необходимости, в непрямом ELISA может быть использована иммунная сыворотка одного и того же животного. В этом случае анализируемый антиген улавливается иммобилизованным на твердой фазе Fab-фрагментом, на которым локализован сайт связывания с антигеном. После этого связанный антиген покрывают целыми гомологичными антителами, а затем полученный «сэндвич» детектируют конъюгатом с антителами, полученными против Fc фрагмента.
Несмотря на то, что DAS-ELISA может быть использован для анализа только поливалентных антигенов, которые имеют, по крайней мере, две детерминанты; а также состоит из нескольких стадий и в связи с этим требует довольно много времени, он обладает рядом достоинств. Среди них решающим является высокая чувствительность, превосходящая возможности других вариантов ELISA. Если принять, что максимальная константа равновесия взаимодействия «антиген — антитело» составляет 1012-М_,ч то, теоретически, предельная чувствительность DAS-ELISA могла бы достигать 10"14М. Достоинством TAS-ELISA является универсальность анти- видового конъюгата, который может быть применен для анализа различных антигенов.
Как следует из описанной выше методики, уровень ферментативной реакции в DAS-ELISA и TAS-ELISA пропорционален количеству антигена, связанного иммобилизованными антителами. Соответственно, уровень поглощения прямо пропорционален количеству анализируемого антигена в образце.
Методика проведения DAS-ELISA может быть упрощена посредством добавления к сорбированным на твердой фазе антителам смеси детектируемого антигена (образца) и конъюгата специфических антител, после кратко-

временного их инкубирования друг с другом в растворе.

Это так называе- 67 мый двустадийный сэндвич-анализ (two-step DAS-ELISA), при котором часть иммунного комплекса между антигеном и конъюгатом антител может формироваться в гомогенных условиях и удаляться при последующей промывке. Следовательно, чем выше концентрация антигена в образце, тем меньше молекул конъюгата будет реагировать с антигеном, захваченном иммобилизованными антителами. Поэтому уровень поглощения будет обратно пропорционален количеству антигена в анализируемой пробе.
Другим вариантом ELISA является DAC (Direct Antigen Coating) анализ, который также называют PTA-ELISA (Plate-Trapped Antigen ELISA). В отличие от DAS-ELISA, в этом варианте иммуноферментного анализа на твердой фазе абсорбируют не антитела, а антигены. Вообще говоря, DAC-ELISA преимущественно используют при исследовании иммунного ответа на конкретный антиген. Он не столь широко применяется для обнаружения и идентификации фитопатогенов, поскольку далеко не всегда анализируют очищенные'антигены с известной структурой и свойствами. Если же такой вариант анализа применим, то следует иметь в виду, некоторые особенности абсорбции разных антигенов. Так, полистирол сорбирует разные белки в зависимости от их концентрации, но он довольно плохо удерживает пептиды, состоящие из 15-20 аминокислотных остатков. Суспензии бактерий и вирусов, имеющие белковые молекулы на своей поверхности, могут быть непосредственно нанесены в лунки с хорошим результатом, но углеводы и гликопротеины с большим содержанием углеводов слабо связываются с полистиролом.
Отметим, что оба описанных здесь варианта ELISA (DAS и DAC) относятся к неконкурентному ИФА, но могут быть трансформированы в конкурентный формат.
Некоторые примеры практического использования ELISA
До появления ELISA было проведено сравнительно небольшое число исследований с использованием антител к фитопатогенным грибам и бактериям. До этого времени с помощью лабораторных иммунологических тестов в основном диагностировали вирусные заболевания, уделяя относительно мало внимания грибным и бактериальным фитопатогенам. В настоящее время ELISA является рутинным лабораторным методом диагностики вироидов, вирусов, фитоплазм, бактерий, грибов и оомицетов в лабораторных условиях и широко используется для обнаружения этих патогенов в растениях, почве, воздухе, а также в других биологических образцах и объектах окружающей среды.
С тех пор, когда в 1977 г. Кларк и Адамс использовали иммунофер- ментный анализ для детекции вирусов растений, список возбудителей болезней, для которых был применен ELISA, постоянно увеличивается. Однако вирусы по-прежнему занимают в нем лидирующее место. Это связано прежде всего с тем, что помимо методов анализа нуклеиновых кислот, только ELISA обеспечивает быструю и надежную диагностику вирусных
68 болезней растений. Простота и высокая производительность ELISA делают его удобным для мониторинга как вирусных заболеваний растений, так и границ распространения их возбудителей. Благодаря использованию ELISA было установлено, что многие вирусы имеют более широкий круг растений-хозяев, чем предполагалось ранее. Нередко оказывалось, что симптомы неизвестной этиологии, обнаруженные на культурных растениях, вызваны вирусом, который не встречался на них прежде. ELISA позволил уточнить ареалы распространения растительных вирусов, и некоторые из них только после внедрения этого анализа были впервые обнаружены в новых географических регионах. Данный метод широко используется для мониторинга вирусов в семенах и посевном материале, например в семенном картофеле, имеющем меристемное происхождение, или в цветочных луковицах (например, только в Голландии ежегодно тестируют сотни тысяч луковиц тюльпанов, лилий и ирисов). Количество примеров применения ELISA для диагностики вирусных болезней слишком велико, чтобы приводить здесь их полный перечень и описывать подробно. Однако, чтобы проиллюстрировать общедоступность этого теста, отметим, что коммерческие реагенты и диагностические наборы разработаны для идентификации более чем сотни вирусов культурных.растений. Среди них, включая изоляты и серотипы, по крайней мере 25 вирусов зерновых злаков (ячменя, кукурузы, риса, сорго, пшеницы, овса) и 3 вируса злаковых трав (костра, травы Джонсона); 7 вирусов зернобобовых и фуражных бобовых растений (фасоли, гороха, сои, вигны, красного клевера); 17 вирусов фруктовых (яблони, банана, вишни, цитрусов, сливы, папайи, персика, ананаса) и 20 вирусов ягодных (голубики, винограда, малины, клубники) культур; 51 вирус овощей, бахчевых и корнеплодов (свеклы, кассавы, цветной капусты, сельдерея, огурца, хмеля, лука-порея, латука, перца, лука, картофеля, редиса, лука-шалота, кабачка, томата, турнепса и цуккини), а также 8 вирусов табака, 2 вируса арахиса и 2 вируса сахарного тростника. Кроме того, доступны коммерческие диагностикумы для обнаружения, по меньшей мере, 29 вирусов цветочных культур и декоративных растений.
ELISA успешно используют для фитопатогенных бактерий. Идентификацию бактерий и сейчас иногда проводят с участием поликлональных антител, но поскольку бактериальные клетки обладают сложным и гетерогенным составом поверхностных антигенов, зависящим от среды, в который они развиваются или в который их культивируют, перекрестные реакции с даже с неродственными видами являются в этом случае типичными для бактериальных патогенов. По этой причине при иммунодиагностике многих видов фитопатогенных бактерий предпочтение отдают моноклональным антителам. В настоящее время ELISA с mABs применяется для детекции и внутривидовой идентификации многих вредоносных возбудителей бактериозов растений, принадлежащих к родам Acidovorax, Agrobacterium, Clavibacter, Corynebacterium Ervinia, Pectobacterium, Pseudomonas, Ralstonia, Xanthomonas, Xylophilus. Чувствительность ELISA для бактерий, как правило, составляет 105- 106 КОЕ мл-1, что достаточно для обнаруже-

ния бактериальных патогенов в пораженном растении и среди колоний, 69 выращенных in vitro. Однако наиболее надежные диагнозы удается поставить, если анализируемый образец получают из зоны активно развивающихся некрозов, где поддерживается высокий титр фитопатогена.
В современной фитопатологии ELISA является удобным и интенсивно применяемы методом детекции различных грибов и оомицетов в растениях, почве, воздухе и других биологических образцах и объектах окружающей среды. Приведенная ниже таблица, в которой представлена информация о тестировании грибов и оомицетов, безусловно, не является исчерпывающей, но тем не менее дает представление о том, с какой целью в отношении этих фитопатогенов может быть использован данный анализ (табл. 3.1). Во-первых, ELISA применяют для детекции патогенов в тканях растений с видимыми признаками поражения, чтобы диагностировать заболевание. Кроме того, ELISA дает возможность обнаруживать латентную инфекцию и выявлять фитопатогенные грибы и оомицеты на ранних стадиях развития заболевания до появления его симптомов. Так как ELISA является количественным методом, с его помощью определяют содержание биомассы патогенов в тканях зараженных растений. Это дает представление о степени колонизации тканей, что в свою очередь, позволяет изучать типы взаимоотношений патогенов с растениями, оценивать эффективность обработок фунгицидами и проводить мониторинг болезней. В ряде случаев ELISA используют для дифференциации видов грибов и оомицетов, а при достаточной специфичности антител и для обнаружения внутривидовых различий. Наконец, метод применяют при контроле качества сельскохозяйственной продукции с целью ее проверки на предмет загрязнения этими микроорганизмами.
Таблица 3.1
Примеры применения ELISA для диагностики грибов и оомицетов

Что касается фитоплазм, то для их диагностики также используют ELISA и с поли- и с моноклональными антителами. Но поскольку весьма трудно выделить очищенные антигены этих возбудителей в достаточном для иммунизации животных количестве, антисывортки удалось получить для сравнительно небольшого числа фито плазм. Тем не менее, для детекции некоторых из них уже выпускаются коммерческие наборы.

<< | >>

Источник: Под ред. Ю. Т. Дьякова. Фундаментальная фитопатология. 2011

Еще по теме Основные варианты ELISA, применяющиеся в фитопатологии:

- Агрохимия и агропочвоведение - Животноводство и промыслы - Защита растений - Земледелие - Овощеводство - Плодоводство - Пчеловодство - Растениеводство - Сад и огород - Селекция и семеноводство с/х культур - Сельскохозяйственные мелиорации -

- Биология - Ветеринария - Взаимоотношения животных - Все животные - Геология - Зоопсихология - Коровы - Кошки - Лечение животных - Лошади - Насекомые - Науки о Земле - Опасные растения и животные - Растительный мир - Редкие животные - Сельское хозяйство - Собаки - Экология -