Определение общего белка в сыворотке крови рефрактометрическим методом.  

Реактив: смесь этилового спирта с эфиром 1:1.

Оборудование: рефрактометры ИРФ-4546, УРЛ, ЯЬ и др.

Ход определения. Устанавливают прибор на нуль по дистиллированной воде при температуре 20 °С. Предварительно верхнюю и нижнюю камеры протирают марлевой салфеткой, смоченной смесью спирта с эфиром, и насухо — ватным тампоном. Поверхность призм при установке прибора на нуль и исследовании образца сыворотки крови должна быть чистой и сухой, от этого во многом зависит результат анализа.

Окуляр шкалы коэффициентов преломления ставят в крайнее положение на себя. Опускают нижнюю половину камеры, на призму наносят 1—2 капли дистиллированной воды. Камеру закрывают, окуляр шкалы и окуляр зрительной трубы устанавливают на резкость. Дисперсию в окуляре зрительной трубы устраняют вращением винта лимба дисперсии.

Линию окуляра шкалы устанавливают на цифру 1,3330 (показатель преломления воды) и в зрительную трубу наблюдают границу светотени по отношению к точке пересечения двух взаимно перпендикулярных линий. Если граница светотени проходит через точку пересечения линий, то прибор установлен на нуль. Если этого нет, то при помощи ключа и маленького винта на корпусе зрительной трубы ставят границы светотени на точку пересечения линий. Поверхность призм досуха вытирают мягкой марлевой салфеткой и ватным тампоном.

Приступают к исследованию образцов крови. Автоматической или обычной пипеткой наносят на нижнюю призму 0,1 мл (2 капли) сыворотки крови и плотно закрывают камеру. Зеркалом направляют свет в окно камеры и поворачивают винт до тех пор, пока граница светотени не достигнет пересечения двух визирных линий.

Расчет. Содержание белка (г/л) определяют по таблице 10 с учетом величины показателя преломления рефрактометра. Если температура в камере во время исследования не соответствует 20 °С, то вводят поправку 0,0001 на каждый градус: в случае низкой температуры поправку вычитают, при более высокой — прибавляют.

10. Вычисление общего белка в сыворотке крови по показателю преломления

Примечание. Рефрактометрический метод дает ошибку в случаях использования сыворотки со следами гемолиза, содержащего много липидов, билирубина, а также сахара и мочевины.

Определение общего белка в сыворотке крови по биуретовой реакции. Принцип. Белки реагируют в щелочной среде с меди сульфатом, образуя соединения, окрашенные в фиолетовый цвет.

Реактивы: 0,9%-ный раствор натрия хлорида (ч. д. а., х. ч.);

0,2 моль/л раствор натрия гидроксида (ч. д. а., х. ч.), свободного от углекислого газа (кипяченая дистиллированная вода);

0,5%-ный раствор калия йодида (ч. д. а., х. ч.) в 0,2 моль/л растворе натрия гидроксида. 0,5 г йодида калия помещают в мерную колбу на 100 мл, доводят 0,2 моль/л раствором натрия гидроксида до метки. Реактив стабилен в течение 2 нед при хранении в посуде из темного стекла;

калий-натрий виннокислый 4-водный (сегнетова соль) (ч. д. а.); меди сульфат 5-водный (ч. д. а., х. ч.);

биуретовый реактив основной. 4,5 г калия-натрия виннокислого 4-водного (КМаСбЩОб • 4Н20) растворяют в мерной колбе на 100 мл в 40 мл 0,2 моль/л раствора натрия гидроксида. После растворения прибавляют 1,5 г меди сульфата (Си304) и 0,5 г калия йодида (К1). Перемешивают до полного растворения и доводят до 100 мл 0,2 моль/л раствором натрия гидроксида. Хранят в посуде из темного стекла. Реактив стоек;

рабочий раствор биуретового реактива. Смешивают одну часть основного биуретового раствора с четырьмя частями 0,5%-ного раствора калия йодида. Хранят в холодильнике в темной посуде не более 2 нед;

калибровочный раствор альбумина основной. В пробирку вносят 1 г кристаллического сывороточного (из человеческой или бычьей сыворотки) альбумина и 9 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида. Тщательно перемешивают. 1 мл раствора содержит 0,1 г белка. Хранят в холодильнике. Сывороточный альбумин должен отвечать требованиям стандарта.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; колбы мерные. Ход определения. К0,1мл сыворотки крови прибавляют 5 мл рабочего раствора биуретового реактива, смешивают, избегая образования пены. Через 30 мин (но не позже чем через 1 ч) измеряют оптическую плотность на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 540—560 нм (зеленый светофильтр) против контроля (5 мл рабочего раствора биуретового реактива и 0,1 мл 0,9 %-ного раствора натрия хлорида).

Расчет ведут по калибровочному графику. При построении калибровочного графика готовят рабочие калибровочные растворы из основного стандартного раствора 10%-ного белка (табл. 11).

11. Приготовление рабочих калибровочных растворов белка

Из каждого из четырех разведений альбумина и одной неразве- денной пробы берут по 0,1 мл и прибавляют по 5 мл рабочего би- уретового реактива. Через 30 мин измеряют экстинкцию на ФЭКе, как в опыте против холостой пробы.

Измерения оптической плотности стандартных растворов начинают с растворов наименьшей концентрации. По полученным данным из пяти определений строят калибровочную кривую, которую периодически проверяют.

Примечания: 1. При содержании белка в сыворотке крови больше 10 % сыворотку разводят физиологическим раствором 1:1, результат умножают на 2. 2. Рефрактометрический и биуретовый методы по точности сравнимы между собой. Биуретовый метод хорошо воспроизводимый, однако необходимо использовать реактивы ч. д. а. или х. ч. Строго соблюдать правила их приготовления и хранения, предъявлять строгие требования к наборам реактивов заводского изготовления, использовать кипяченую дистиллированную воду.

Источники: 43, 67.

Клиническое значение. Белки крови выполняют многие функции: поддерживают постоянство онкотическош давления, pH крови, уровень катионов крови, играют важную роль в образовании иммунитета, комплексов с углеводами, липидами, гормонами и другими веществами.

Альбумины и фибриноген крови образуются в печеночных клетках, глобулины — в клетках ретикуло-эндотелиальной системы костного мозга и ретикулоэндотелиальных (купферовых или звездчатых) клетках печени. Поэтому содержание сывороточных белков во многом зависит от состояния печени. При болезнях печени снижается синтез альбуминов и фибриногена, увеличивается образование глобулинов (за исключением цирроза), наступает дис- протеинемия, нарушаются процессы обновления белков.

Нормативы содержания общего белка сыворотки крови приведены в приложениях 5—7.

Снижение количества общего белка в сыворотке крови (гипопро- теинемия) отмечается при длительном недокорме животных, алиментарной остеодистрофии, уровской болезни, гипокобальтозе, эндемическом зобе, хронических расстройствах желудочно-кишечного тракта, нефрите, нефрозе, циррозе печени, туберкулезе и других заболеваниях, при которых снижаются аппетит и усвоение питательных веществ корма.

Повышение уровня общего белка в сыворотке крови (гиперпротеи- немия) в условиях интенсивного животноводства встречается значительно чаще, чем гипопротеинемия. Оно бывает при белковом перекорме, кетозе, вторичной остеодистрофии, токсикозах и других болезнях, сопровождающихся дистрофией или воспалением печени. Повышение содержания общего белка в сыворотке крови в этих случаях идет за счет глобулиновых фракций при одновременном уменьшении концентрации альбуминов.

Гиперпротеинемия бывает при тяжелых формах диареи, дегидратации организма, острых воспалительных процессах, флегмоне, сепсисе, пневмонии, бронхопневмонии и др.

Примечание. Концентрация общего белка в плазме крови на

3. 5 г/л больше, чем в сыворотке, вследствие присутствия в ней фибриногена. После кормления содержание белка повышается.