Определение токоферолов в тканях и сыворотке крови методом колоночной хроматографии.
Реактивы: 96%-ный этиловый спирт; абсолютный этиловый спирт; чистый бензол (без тиофена); концентрированная серная кислота (Н2804); безводный натрия сульфат;
оксид алюминия для хроматографии, сильно активированный; петролейный эфир; углекислота или азот;
0,2%-ный раствор железа хлорного (РеС1з)в абсолютном спирте; 0,5%-ный раствор а,а'-дипиридила в абсолютном спирте; стандартный раствор токоферола (250 мг 0,Ь-а-токоферола растворяют в мерной колбе ледяной уксусной кислотой до объема 250 мл).
Оборудование: адсорбционная колонка; фотоэлектроколориметр; колбы; пипетки; пробирки; бюхтеревская воронка; делительная воронка; песочная баня.
Очистка алюминия оксида.
400 г алюминия оксида, используемого в качестве адсорбента, суспензируют в 200 мл концентрированной Н2804, в которой до этого было растворено 20 г цинка хлорида. Добавляют 20 мл дистиллированной воды и ставят колбу в холодильник на 72 ч. Подготовленный таким образом алюминия оксид переносят в бюхтеровскую воронку, промывают обычной водой до нейтральной реакции, затем ацетоном и сушат на воздухе. Отвешивают необходимое количество приготовленного адсорбента и прокаливают его в муфельной печи при температуре 450 °С в течение 6 ч. Перед употреблением влажность алюминия оксида доводят дистиллированной водой до 9 %.Адсорбционная колонка. Хроматографию проводят в стеклянной трубке диаметром 10 мм, заполненной адсорбентом на высоту 80 мм. Рыхлость слоя должна быть такой, чтобы он пропускал 30 капель за 1 мин. Для предотвращения увлажнения адсорбента сверху насыпают безводный натрия сульфат. Перед началом хроматографии через колонку пропускают чистый петролейный эфир (5—6 мл), регулируя скорость капания.
Ход определения.
2 мл сыворотки (плазмы) крови вносят в сухую делительную воронку (50 мл), прибавляют 10 мл этилового спирта, смесь энергично встряхивают 3 мин, после чего дважды экстрагируют 10 мл бензола при встряхивании по 3 мин. Объединенный безбелковый экстракт со следами спирта высушивают над безводным натрия сульфатом в защищенном от света месте.Навеску ткани (1—3 г) гомогенизируют с 20 мл спиртово-бензольной смеси (1 : 1), переносят в круглодонную колбу, закрывают пробкой и экстрагируют в течение 30—40 мин. После этого спиртово-бензольный экстракт фильтруют в делительную воронку и омыляют свежеприготовленным 50%-ным раствором КОН (55 % объема омыляемого вещества). Так как токоферол очень чувствителен к воздействию щелочей и легко ими разрушается, процесс омыления проводят при полном отсутствии кислорода или под защитой антиокислителей. С этой целью в делительную воронку несколько раз вводят С02 или высыпают 50—100 мг пирогаллола.
После окончания омыления в делительную воронку добавляют 50 мл дистиллированной воды с 1 мл концентрированной Н2804 для нейтрализации КОН. Тщательно взбалтывают смесь и отделяют бензольную фракцию. Содержимое воронки промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции. Экстракт сушат в колбе над безводным натрия сульфатом. Высушенный бензольный экстракт фильтруют в низком тигле, споласкивая осадок чистым бензолом, и выпаривают досуха на песочной бане при температуре 60 °С.
Хроматография. Неомыленный осадок растворяют в эфире трижды, используя по 5 мл его каждый раз, и наносят на подготовленную адсорбционную колонку. Каротиноиды вымывают петро- лейным эфиром. Токоферол экстрагируют 5—6 раз бензолом (по 1 мл). Элюат выпаривают в токе нейтрального газа, а сухой остаток растворяют в абсолютном спирте и доводят объем до 4,6 мл. Добавляют 0,2 мл а,а'-дипиридила. Колориметрируют при 490 нм через 2,5 мин после добавления РеС1з- Расчет ведут по калибровочному графику, построенному по стандартному раствору -а-токоферола.
Источники: 74, 75.
Клиническое значение.
Богаты токоферолами растительные масла, зародыши пшеницы, ячменя и других злаковых культур. Всасываются токоферолы в тонком кишечнике при наличии в корме жиров. Непосредственное участие в этом процессе принимают желчные кислоты. Основная функция токоферола — регуляция интенсивности свободных радикалов в клетках, ограничение скорости процессов перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот в липидах биологических мембран. Благодаря токоферолу обеспечивается стабильность клеточных мембран. Токоферолы защищают витамин А от перекисного окисления, являются си- нергистами селена — тормозят перекисное окисление липидов. Селен как кофактор глутатионпероксидазы участвует в инактивиро- вании гидропероксидов липидов.Недостаточность токоферола сопровождается усилением процессов перекисного окисления липидов, атрофией семенников и бесплодием, рассасыванием плода на ранних сроках беременности, мышечной дистрофией, некрозами печени и мозга и т. д.
В норме сыворотка крови здоровых животных содержит 0,6—
- мг% (14—34 мкмоль/л) токоферолов. У новорожденных животных их 0,3—0,5 мг% (7—12 мкмоль/л). Причина гиповитаминоза Е — недостаток в кормах токоферолов, плохое их усвоение вследствие заболевания печени, желудка и кишечника. Уровень витамина Е в крови также зависит от степени обеспеченности организма (З-липопроте- идами, ответственными за транспорт токоферолов в организме.
Еще по теме Определение токоферолов в тканях и сыворотке крови методом колоночной хроматографии. :
- Определение общего белка в сыворотке крови рефрактометрическим методом.
- Определение активности а-амилазы в сыворотке крови, моче, дуоденальном содержимом амилоклассическим методом со стойким крахмальным субстратом (метод Каравея).
- Определение белковых фракций в сыворотке крови турбидимет- рическим (нефелометрическим) методом.
- Определение витамина Е в сыворотке крови (см. с. 195). Определение церулоплазмина в сыворотке крови.
- Определение свободного аминного азота в сыворотке крови по методу Г. А. Узбекова в модификации 3. С. Чулковой.
- Определение токоферолов в плазме крови с а,а'-дипиридилом (2, 2'-дипиридил).
- Определение билирубина в сыворотке крови животных по методу Ендрассика—Клеггорна—Грофа в модификации В. И. Левченко и В. В. Влизло.
- Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по гидролизу р-глицерофосфата (метод Бодански).
- Определение билирубина в сыворотке крови по диазореакции (метод Ендрассика—Клеггорна—Грофа).
- Определение активности сорбитолдещдрогеназы (СДГ) в сыворотке крови по реакции с резорцином (метод Севела—Товарека).
- Определение белковых фракций в сыворотке крови.