Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по гидролизу р-глицерофосфата (метод Бодански).  

Реактивы: глицерофосфатный субстрат, pH 9,0 ± 0,1.

10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ);

серная кислота концентрированная (плотность 1,84);

раствор аммония молибдата (ч. д. а.). 100 г вещества растворяют в 500 мл воды, подогретой до 50 °С. После охлаждения приливают 100 мл концентрированной серной кислоты, снова охлаждают и переносят в мерную колбу на 1 л, доливают дистиллированной водой до метки;

раствор аммония ванадата (ч. д. а.). 2,5 г вещества растворяют в 500 мл кипящей дистиллированной воды. Кипячение продолжают до тех пор, пока раствор не окрасится в желтый цвет. После охлаждения раствор переносят в мерную колбу на 1 л и доводят объем дистиллированной водой до метки;

реактив на фосфор. Смешивают растворы аммония молибдата и ванадата в равных объемах. Реактив годен 2 мес;

стандартный раствор фосфора основной. 0,439 г калия фосфата однозамещенного (х. ч.), высушенного над концентрированной серной кислотой, растворяют в 100 мл дистиллированной воды. В 1 мл раствора содержится 1 мг фосфора. Из него готовят рабочий стандартный раствор. Берут 5 мл основного раствора и доводят объем дистиллированной водой в мерной колбе на 100 мл до метки.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; термостат; эксикатор; электроплитка.

Ход определения. В центрифужные пробирки вносят по

5. мл Р-глицерофосфатного субстрата и ставят в термостат при 37 “С на 15 мин.
   На каждую пробу берут 2 пробирки (№ 1 и 2) и на серию исследований 2 пробирки на контроль (№ 3 и 4) и 2 пробирки на субстрат (№ 5 и 6). Через 15 мин в пробирку № 1 добавляют 0,5 мл сыворотки и продолжают нагревать все пробирки в термостате при 37 °С в течение 1 ч (точно). Пробы охлаждают. В пробирку № 2 вносят 0,5 мл сыворотки, в № 3 и 4 — по 0,5 мл дистиллированной воды, в № 5 и 6 — по 0,5 мл рабочего стандартного раствора фосфора.

Во все пробирки вносят по 2 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют в течение 15 мин при 3000 мин“1. Затем берут

5. мл надосадочной жидкости, добавляют 2,5 мл реактива на фосфор, перемешивают стеклянной палочкой и оставляют стоять 2 ч. Центрифугируют 5 мин при 3000 мин-1.

Фотометрируют пробы и стандарт при длине волны 436 нм (фиолетовый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против контроля. Контроль ставят так же, как опыт, но вместо центрифугата берут 2,5 мл ТХУ и 2 мл дистиллированной воды.

Расчет ведут по формулам

х{ = А\/В • 5 и х2 = А^В ¦ 5,

где XI — количество неорганического фосфора, содержащегося в 100 мл сыворотки крови после ее инкубации, мг; х2 — количество неорганического фосфора, содержащегося в 100 мл сыворотки крови до инкубации, мг; А\ — оптическая плотность исследуемой пробы после инкубации; Л2 оптическая плотность испытуемой пробы до инкубации; В — оптическая плотность рабочего стандартного раствора фосфора; 5 — коэффициент (для 5 мг%-ного стандартного раствора фосфора).

Разница в содержании неорганического фосфора до и после инкубации условно обозначается единицами Бодански. По СИ активность фермента выражают в микромолях неорганического фосфора на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации при 37 °С.

_ а • 1000 • 4 31

где х — активность фермента; а — количество неорганического фосфора, найденное по калибровочному графику, мг; 1000 — пересчет неорганического фосфора в мг; 4 — коэффициент пересчета на 1 мл сыворотки; 31 — масса 1 мкмоля неорганического фосфора, мг.

Примечание.

Клиническое значение. Щелочная фосфатаза так же, как и кислая фосфатаза, отщепляет остаток фосфорной кислоты от ее органических эфирных соединений. В сыворотке крови может быть фермент из костной ткани, печени, желчных путей, кишечника и других тканей. В норме активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови равна 1,2—5 ед. Бодански или около 0,4—1,4 мкмоль/мл за 1 ч инкубации при 37 °С, или 110—390 нмоль/с - л.

Щелочная фосфатаза не является строго органоспецифическим ферментом. Значительное повышение ее активности отмечают при холангитах, холецистите, желчекаменной болезни, рахите, остеодистрофии. Несущественные изменения находят при гепатитах, злокачественных новообразованиях, циррозе печени.

Источники: 29, 39.

Примечания. 1. Есть унифицированный метод определения щелочной фосфатазы в сыворотке крови по гидролизу л-нитрофенилфосфата по Бессея—Лоури. Для определения активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по Бадански изготовляются наборы реактивов. 2. В герметически закрытой пробирке сыворотку можно хранить 7 дней при комнатной температуре. 3. Умеренный и сильный гемолиз, липемия, билирубинемия завышают результаты. В плазме активность выше, чем в сыворотке.