Флуориметрический метод определения общего тиамина в крови и печени (по Г. Д. Елисеевой).  

Реактивы: калибровочный раствор тиамина.

2%-ный раствор калия железосинеродистого [К2Ре(СК)б] — красной кровяной соли, свежеприготовленный;

30%-ный раствор натрия гидроксида;

96%-ный спирт этиловый;

0,25моль/л раствор хлористоводородной кислоты;

изо-бутиловый (изо-амиловый) спирт, насыщенный водой;

20%-ный раствор натрия карбоната (ЙагСОз);

20%-ный раствор трихлоруксусной кислоты;

фосфатаза щелочная лиофильная;

универсальный индикатор или 0,04%-ный спиртовой раствор бромкрезоловый пурпуровый.

Для того чтобы спирты (изобутиловый, изоамиловый, этиловый) не флуоресцировали, их очищают путем взбалтывания с активированным углем и последующего фильтрования до полного отсутствия сине-голубого свечения на флуориметре.

Оборудование: флуориметр типа ЭФ-3; термостат; водяная баня; ступки фарфоровые; стаканчики сахарные (Хагедорна); цилиндры на 100 мл с притертыми пробками; делительные воронки; пипетки; пробирки центрифужные без деления и с делением.

Ход определения. В стаканчик Хагедорна или большую пробирку вносят 1 мл оксалатной крови (2—3 мг оксалата на 1 мл крови), 10 мл 0,25 моль/л соляной кислоты и нагревают в кипящей водяной бане в течение 15 мин для частичного разрушения флуоресцирующих примесей. К теплому раствору при взбалтывании прибавляют по каплям 20 %-ный раствор натрия карбоната до получения pH 5,2 (по универсальному индикатору или по 0,04 %-но- му раствору бромкрезолпурпура).

24. ч при 37 °С для ферментативного расщепления кокарбоксилазы.

По истечении этого времени смесь нагревают в течение 3 мин на кипящей водяной бане. Затем через фильтр, предварительно отмытый от флуоресцирующих веществ горячей бидистиллирован- ной водой, раствор фильтруют в чистый стаканчик Хагедорна. Остающийся при этом на фильтре осадок во избежание потери тиамина промывают с добавлением 3 мл горячей бидистиллированной воды. Смесь после нагревания можно центрифугировать при 3000 мин 1 в течение 10—15 мин.

К полученному желтоватому раствору прибавляют 2 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения остальной части белков. Смесь нагревают на водяной бане при 40—50 °С в течение 10 мин, после чего снова фильтруют через другой отмытый фильтр в делительную воронку. Остаток на фильтре, как и в первый раз, промывают 3 мл горячей бидистиллированной воды. К фильтрату добавляют двойной объем изоамилового спирта. Смесь энергично встряхивают 2 мин для извлечения мешающих определению тиамина примесей и оставляют до разделения слоев (примерно на

2. ч). Верхний слой — изоамиловый спирт с посторонними флуоресцирующими веществами отбрасывают. Центрифугируют при 3000 мин-1 в течение 15 мин. Нижний, водный, слой делят на две равные части, разливая в делительные воронки (или большие пробирки). Одна служит опытом, другая — контролем.

В опытную пробу вносят смесь, состоящую из 2 мл 1 %-ного раствора красной кровяной соли (калия железистосинеродистого) и 2 мл 30%-ного раствора натрия гидроксида (смесь готовят перед применением и выдерживают 2 мин). В контрольную пробу добавляют 2 мл 30%-ного раствора натрия гидроксида. В обе делительные воронки с приготовленными таким образом растворами приливают по 8 мл изоамилового спирта.

Одновременно точно так же, как опытные пробы, обрабатывают калибровочный раствор тиамина с содержанием 1 мкг в 1 мл.

Флуориметрия. Настраивают флуориметр по калибровочному раствору тиамина путем регулирования светового потока до тех пор, пока стрелка гальванометра не покажет величину, выбранную для калибровочного раствора (обычно на делении 40 или 80). Используют флуориметр, снабженный чувствительным гальванометром, специфическим светофильтром с максимумом поглощения около 390 нм и одинаковыми пробирками или кюветами из нефлуоресцирующего стекла. В каждую из взятых пробирок вносят около 8 мл испытуемых окисленных и неокисленных изоами- ловых растворов (опыт и контроль), а также изоамиловые растворы окисленного и неокисленного калибровочного раствора тиамина и определяют интенсивность флуоресценции по шкале гальванометра.

Расчет количества общего тиамина ведут по формуле

х = (А-В}К . [0{)1 И

где х — содержание тиамина в 100 мл крови, мкг%; А — показатель гальванометра для опытной пробы; В — показатель гальванометра для контрольной пробы; К — цена одного деления шкалы гальванометра при данном режиме работы, мкг тиамина; Н— количество крови, взятой в опытную пробу, мл; 100 — коэффициент для перевода в проценты.

Ход определения общего тиамина в печени. Навеску печени массой 3 г растирают в фарфоровой ступке с кварцевым песком, приливают 15 мл 0,25 моль/л раствора кислоты хлористоводородной, размешивают и выливают в стаканчик Хаге- дорна или в большую пробирку. Ступку промывают еще 5 мл 0,25 моль/л раствора кислоты хлористоводородной и выливают в этот же стаканчик. Исследование проводят, как описано в методике определения общего тиамина в крови.

Расчет проводят по формуле

_= (А-В)К Н ’

гдех— содержание тиамина, мкг/г; А — показатель гальванометра для опытной пробы; В — показатель гальванометра для контрольной пробы; К — цена одного деления шкалы гальванометра при данном режиме работы; Н — масса навески ткани, г.

Источник: 75.

Клиническое значение. Тиамин животным поступает с кормом в свободном, этерифицированном и связанном видах. В кровь в основном попадает свободный тиамин, который фосфо- рилируется в печени. Часть его в виде свободного тиамина поступает в общий кровоток и распределяется по другим тканям. В тканях основная масса тиамина фосфорилируется до тиаминди- фосфата (ТДФ), который является коферментной формой витамина В1. ТДФ катализирует реакции окислительного декарбоксили- рования а-кетокислот, участвуя таким образом в процессе аэробного окисления углеводов, взаимопревращения аминокислот. Недостаток тиамина сопровождается торможением процесса распада пировиноградной кислоты и накоплением ее в крови и моче.

О              степени обеспеченности организма тиамином судят по его содержанию в крови, моче, печени, а также по содержанию в крови и моче пировиноградной кислоты. В крови, тканях и других биологических объектах постоянно присутствует сам тиамин и его производные: ТДФ, тиаминмонофосфат (ТМФ), тиохром. В крови в основном содержится фосфорилированный тиамин (ТДФ и др). Свободного тиамина в крови очень мало (0,3—0,9 мкг%), поэтому для клинических целей исследуют общий тиамин. Однако при заболеваниях почек целесообразно определять в крови и моче также и свободный тиамин.

Содержание общего тиамина в крови колеблется в пределах 7—15 мкг%, в печени 8—13 мкг/г. При этом в плазме крови обнаруживается преимущественно свободный тиамин, в эритроцитах и лейкоцитах — фосфорилированный. Сезонной зависимости содержания тиамина в крови не обнаружено.

Гиповитаминоз В) проявляется при содержании общего тиамина в цельной крови ниже 5—6 мкг%, в печени менее 0,3 мкг/г. Уровень пировиноградной кислоты при этом превышает 0,7—1,2 мг%. В условиях интенсивного выращивания и откорма бычков в пром- комплексах при содержании общего тиамина в крови 5 мк% и ниже И. С. Шалатонов (1982) отмечал выраженные признаки алопеции. Низкий уровень тиамина в крови, печени и других тканях наблюдается при цереброкортикальном некрозе. Подавляется бактериальный синтез витамина В| в желудочно-кишечном тракте при скармливании животным антибиотиков и аминазина.