Определение билирубина в сыворотке крови по диазореакции (метод Ендрассика—Клеггорна—Грофа).  

Реактивы: кофеиновый реактив. 5 г чистого кофеина, 7,5 г натрия бензоата, 12,5 г натрия ацетата растворяют в 90 мл дистиллированной воды, нагревают до 50—60 °С, хорошо перемешивают. После охлаждения доводят дистиллированной водой до 100 мл. Срок хранения 2 нед;

натрия хлорид (ч. д. а. или х. ч.), 154 моль/л. 0,9 г натрия хлорида помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят водой до метки. НС1 концентрированная (ч. д. а., х. ч.); сульфаниловая кислота (ч. д. а.);

диазореактив I. 5 г сульфаниловой кислоты растворяют при нагревании в 300—400 мл дистиллированной воды, прибавляют 15 мл концентрированной НС1 (плотность 1,19 кг/м3). Если сульфаниловая кислота полностью не растворяется, колбу помещают в теплую воду и помешивают. Только после полного растворения сульфаниловой кислоты и охлаждения раствор доливают дистиллированной водой до 1 л. Реактив стойкий, хранят в посуде из темного стекла;

диазореактив II. Натрия нитрит (№N02, ч. д. а., х. ч.), 5 г/л (0,07 моль/л). 0,5 г натрия нитрата помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой до метки. Реактив стабилен в течение 2 нед при хранении в посуде из темного стекла. Перед работой смешивают 10 мл диазореактива I и 0,3 мл диазореактива II;

билирубин для построения калибровочного графика, 800 мг/л, или 1368 мкмоль/л. Коммерческие препараты кристаллического билирубина содержат разные примеси, которые могут мешать реакции азосочетания. Рекомендуется использовать наборы отечественных или зарубежных фирм, содержащие билирубин высокой степени чистоты.

натрия карбонат, 0,1 моль/л. 10,6 г безводного №гСОз растворяют и доводят до 1 л дистиллированной водой;

уксусная кислота, 4 моль/л. 25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 100 мл дистиллированной водой.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; колбы мерные.

Ход определения. ВЗ пробирки (для общего и связанного билирубина и для контроля) вносят реактивы, как указано в таблице 16.

16. Смеси реактивов для определения билирубина в сыворотке крови

Для определения связанного билирубина измерение на фотоэлектроколориметре проводят через 5—10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин.

Измерение проводят при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против воды. Из показателей, полученных при колориметрировании общего и связанного билирубина, вычитают показатель контроля.

Расчет ведут по калибровочному графику. Находят содержание общего и связанного билирубина. Для определения уровня непрямого билирубина вычитают из показателя общего его содержания показатель прямого билирубина.

Способ 1. Калибровочный график строят по способу Шелон- га—Венде с использованием стабилизирующего свойства белка сыворотки крови.

Реактивы для построения калибровочного графика. 1. Основной раствор билирубина. Препараты кристаллического билирубина отличаются по своим свойствам. Не каждый билирубин может быть использован для построения калибровочного графика. Допустим лишь тот билирубин, 1 мг%-ный раствор которого при растворении в хлороформе (для наркоза) при 25 °С дает на спектрофотометре абсорбцию от 1,01 до 1,07 при длине волны 453 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

В колбе вместимостью 50 мл растворяют 40 мг билирубина (имеющийся в продаже билирубин является непрямореагирую- щим) в 30—35 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия (10,6 г безводного Иа2СОз доводят до 1 л дистиллированной водой) и хорошо перемешивают, не допуская образования пузырьков. Доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором ИагСОз и несколько раз перемеши

вают. Раствор стоек только в течение 10 мин от начала приготовления. В дальнейшем билирубин окисляется.

2. Рабочий раствор билирубина. К 13,9 мл свежей негемолизи- рованной сыворотки крови добавляют 2 мл свежеприготовленного раствора билирубина и 0,1 мл (4 моль/л) раствора уксусной кислоты (25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 100 мл дистиллированной водой).
   Хорошо перемешивают. При этом выделяются пузырьки углекислого газа. Рабочий раствор стоек в течение нескольких дней. Он содержит на 10 мг% билирубина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления раствора. Чтобы исключить при расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыворотке крови, при измерении на ФЭКе из величины экстинкции калибровочных проб вычитают величины экстинкции соответствующих разведений компенсационной жидкости.

Для приготовления компенсационной жидкости смешивают

9. мл той же сыворотки, которая использовалась для приготовления калибровочного раствора билирубина, 2 мг 0,1 моль/л раствора ИагСОз и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты.

Для построения калибровочного графика готовят ряд разведений с различным содержанием билирубина (табл. 17).

17. Разведения билирубина для построения калибровочного графика

К полученным разведениям прибавляют по 1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазосмеси.

Способ 2. Калибровочный график строят по готовым наборам реактивов, выпускаемых отечественными и зарубежными фирмами. Калибровочная кривая линейна до 170 мкмоль/л.

Подбор реактивов в коммерческих наборах основан также на диазореакции, положенной в основу метода Ендрассика—Клеггор- на—Грофа.

Примечание. Сыворотка или плазма крови должны быть свежими, свободными от гемолиза, прозрачными. Плазму или сыворотку крови хранят не более двух дней при температуре 4—25 °С. Исследования проводят незамедлительно. Образцы крови защищают от света.

Источник: 43.