Определение свободного аминного азота в сыворотке крови по методу Г. А. Узбекова в модификации 3. С. Чулковой.  

Принцип. Аминокислоты при взаимодействии с нингидри- ном подвергаются окислительному дезаминированию и декарбок- силированию. Нингидрин, восстанавливаясь, вступает в реакцию с продуктами этой реакции — образуется соединение, окрашенное в фиолетовый цвет. Интенсивность окрашивания при определенных условиях пропорциональна количеству свободных аминокислот.

Реактивы: 0,04 моль/л раствор уксусной кислоты — 0,23 мл ледяной уксусной кислоты (СН3СООН) на 100 мл воды; 1%-ный раствор нингидрина.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; водяная баня; пробирки с меткой на 10 мл.

Ход определения. Исследование проводят поэтапно.

1. Осаждение белков. В центрифужную пробирку вносят 0,5 мл сыворотки крови, 0,5 мл 0,04 моль/л раствора ледяной уксусной кислоты, закрывают пробкой и помещают в холодную водяную баню, которую доводят до кипения. Пробы прогревают в водяной бане в течение 5 мин (с момента закипания). Затем пробирки охлаждают и содержимое их фильтруют.
2. Фильтрование. К содержимому пробирки добавляют 1 мл дистиллированной воды, перемешивают тонкой стеклянной палочкой и фильтруют через гладкий бумажный фильтр. Пробирку и осадок на фильтре промывают еще 2 раза по 1 мл водой, после чего основной фильтрат и промывные воды объединяют в одну пробирку с меткой на 10 мл.
3. Цветная реакция с нингидрином. К полученному фильтрату добавляют 0,5 мл 1%-ного водного раствора нингидрина, содержимое пробирки перемешивают и помещают в кипящую водяную баню на 20 мин.
   Затем пробирку охлаждают в водопроводной воде, оставляют стоять 5 мин при комнатной температуре и доводят объем дистиллированной водой до 10 мл (по метке на пробирке). Одновременно ставят контроль на реактивы. К 3 мл дистиллированной воды добавляют 0,5 мл 0,04 моль/л раствора ледяной уксусной кислоты, 0,5 мл 1%-ного водного раствора нингидрина, перемешивают, прогревают на кипящей водяной бане в течение 20 мин, охлаждают под струей водопроводной воды и доводят дистиллированной водой до 10 мл. В качестве контроля можно пользоваться обычной дистиллированной водой.
4. Колориметрия. Оптическую плотность пробы измеряют на ФЭКе при длине волны 536 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 5 мм против контроля или дистиллированной воды.

Расчет. По калибровочной кривой, построенной по азоту аланина или другой какой-либо аминокислоты с известным содержанием азота (кроме триптофана, лизина, цистина), находят количество мкг азота, соответствующее полученным значениям экстинк- ций.

Для перевода в мг% найденный результат умножают на 200 и делят на 1000, т. е. умножают на 0,2 (в случае, если берут 0,5 мл сыворотки).

Пример: экстинкция пробы составляет 0,212, а количество азота, найденное по калибровочной кривой, — 16,42 мкг. Отсюда концентрация аминного азота представляет величину 16,42 • 0,2 = 3,284 мг% аминного азота.

Аналогичный результат можно получить при следующей пропорции:

0,5 мл сыворотки — 16,42 мкг

100 мл сыворотки — х,

х = (16,42 • 100) : 0,5 = 3284 мкг% = 3,284 мг%.

Клиническое значение. У здоровых животных в сыворотке (плазме) крови содержится от 4 до 8 мг% свободного аминного азота.

Снижается количество аминного азота при длительном недокорме, голодании, нефрозе, хронических расстройствах функций желудочно-кишечного тракта, при жировой дистрофии печени вследствие кетоза.

Повышается уровень аминного азота в крови после приема богатого протеином корма, острой токсической дистрофии печени (печеночной коме), отравлении фосфором и другими ядами, лихорадке.

Источник'. 32.