Определение активности сорбитолдещдрогеназы (СДГ) в сыворотке крови по реакции с резорцином (метод Севела—Товарека). 

Реактивы: трис-(оксиметил)-аминометан;

кислота хлористоводородная (НС1) 0,2 моль/л;

0,5 моль/л раствор О-сорбитола в 0,05 моль/л трис-буфере.

0,05 моль/л трис-буфер, pH 8,8. 70,5 мг трис-(оксиметил)-ами- нометана растворяют в 2,5 мл дистиллированной воды, прибавляют 0,4 мл 0,2 моль/л раствора НС1. Доводят pH до 8,8, доливают дистиллированной водой до 10 мл. Раствор стабилен 1 год в случае хранения при комнатной температуре;

0,006 моль/л раствор никотинамидадениннуклеотида (НАД). 25 мг НАД растворяют в 4,5 мл трис-буфера. Раствор стабилен в течение 4 нед при хранении в холодильнике;

100 г/л (10 г/100 мл) раствор трихлоруксусной кислоты;

0,1%-ный раствор резорцина в 96%-ном этиловом спирте;

30%-ный раствор хлористоводородной кислоты (НС1);

0,2 моль/л раствор хлористоводородной кислоты (НС1);

154 ммоль/л раствор натрия хлорида;

калибровочный раствор фруктозы. 27 мг D-фруктозы растворяют в небольшом количестве 154 ммоль/л раствора натрия хлорида, переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят объем до метки 154 ммоль/л раствором натрия хлорида.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; термостат; колбы мерные; секундомер.

Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 0,1 мл 0,5 моль/л раствора D-сорбитола и 0,3 мл сыворотки, прогревают 5 мин при 37 °С, затем добавляют 0,2 мл 0,006 моль/л раствора НАД, предварительно прогретого при 37 °С и инкубируют 30 мин при 37 °С.

Холостую пробу ставят так же, как опытную, но раствор трихлоруксусной кислоты добавляют до инкубации.

Расчет активности фермента производят по калибровочному графику. Активность СДГ выражают в микромолях фруктозы, образовавшейся при инкубации 1 мл сыворотки в течение 1 ч при 37 °С, или в нмолях фруктозы, образовавшейся при инкубации 1 л сыворотки в течение 1 с при 37 °С. Для перевода мкмолей (ч. мл) в нмоль/с ‘л найденную величину умножают на коэффициент 16,67.

Для построения калибровочного графика из калибровочного раствора D-фруктозы готовят ряд разведений с добавлением реактивов, как указано в таблице 34.

34. Разведения фруктозы для построения калибровочного графика

№

про

бир

ки

Активность СДГ, нмоль/с - л

1 0,2 калибро- 0,10 0,1 0,2 0,4 0,1 3,0 55,6 вочного раствора, разведенного в 10 раз

0,9%-ным раствором NaCl

Далее калибровочные пробы помещают в водяную баню при 80 °С на 8 мин, охлаждают и измеряют при тех же условиях, что и опытные пробы, против холостой пробы. В холостую пробу вместо калибровочного раствора добавляют 154 ммоль/л раствор натрия хлорида.

Пересчет активности сорбитолдегидрогеназы на микромоли фруктозы на 1 л сыворотки за 1 с инкубации при 37 °С производят по формуле

С- 1000-3300-2 180-3600

где х — активность сорбитолдегидрогеназы, нмоль/ с-л; С-1000 — количество О-фруктозы в калибровочной пробе, нм; 3300 — коэффициент пересчета на 1 л сыворотки; 2/3600 — коэффициент пересчета на 1 с инкубации; 180 — масса 1 ммоля О-фруктозы, мкг.

Линейная зависимость сохраняется от 0 до 830 нмоль/с • л.

Примечания.

2. 8 “С.

Источник: 43.

Для определения СДГ в сыворотке крови имеется набор реактивов заводского изготовления, в основу которого положен изложенный выше метод.

Клиническое значение. СДГ содержится главным образом в клетках печени. У здоровых животных ее активность в крови не определяется из-за небольшой чувствительности методов. Повышение активности СДГ в сыворотке крови устанавливают при остром гепатите, токсической гепатодистрофии, при обострении хронического гепатита, синдроме цитолиза гепатоцитов.