МЕТОДЫ ОБЩЕГО КЛИНИЧЕСКОГО АНАЛИЗА КРОВИ  

Подсчет эритроцитов в камере Горяева. Принцип. Точное количество крови равномерно смешивают в определенном количестве жидкости и помещают в камеру с известным объемом, в котором взвесь крови распределяется одним слоем. Дно камеры разграфлено, благодаря чему возможен точный подсчет эритроцитов.

Реактивы: 0,9%-ный раствор натрия хлорида.

Специальное оборудование: микроскоп, камера Горяева, пробирки лабораторные или капилляр от гемометра Сали.

Ход определения. В сухую чистую пробирку вносят 8 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида и капиллярной пипеткой 0,02 мл крови. Предварительно кончик пипетки вытирают, кровь выдувают на дно пробирки, а пипетку тщательно промывают верхним слоем жидкости. Содержимое пробирки хорошо перемешивают. Получают разведение крови 1 : 400, т. е. кровь разбавляют в 400 раз. При сгущении крови ее целесообразно разбавить в 500, 600, 700, 800 раз.

Камера и покровное стекло должно быть вымыты и насухо вытерты. Покровное стекло притирают к камере так, чтобы появились радужные кольца. Берут каплю разведенной крови из пробирки и заполняют ею камеру, нанося к краю покровного стекла. Эритроциты подсчитывают через 1 мин после заполнения камеры под малым увеличением микроскопа (объектив х8, окуляр хЮ или х15) с прикрытой диафрагмой или опущенным конденсатором (в затемненном поле зрения). Эритроциты подсчитывают в пяти больших (или 80 малых) квадратах, расположенных по диагонали.

Расчет. Подсчитанное число клеток в 80 малых квадратах умножают на 20 000 при разведении крови 1 : 400, на 25 000 при разведении 1 : 500 или на 30 000 при разведении 1 : 600 и получают окончательный результат в миллионах в 1 мкл. При этом исходят из того, что объем одного малого квадрата равен 1/4000 мкл. Для подсчета клеток в 1 л количество эритроцитов в 1 мкл еще умножают на 1 000 000 (10 /л).

Примечание. Не допускается исследование крови со сгустками;

подсчет клеток тотчас после заполнения камеры (не выжидая 1 мин); использование плохо вымытых и просушенных пипеток и пробирок, недоброкачественных реактивов, вызывающих гемолиз. При соблюдении всех правил подсчета ошибка составит в среднем +2,5 %.

Подсчет лейкоцитов в камере Горяева. Принцип. Количество лейкоцитов подсчитывают в определенном объеме камеры с известным разведением крови.

Реактивы: 3%-ный раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовым синим или генцианом фиолетовым из расчета 1 мл 1%-ного водного раствора красителя на 100 мл уксусной кислоты.

Оборудование: микроскоп, камера Горяева,, пробирки, микропипетки или капилляр от гемометра Сали.

Ход определения. От каждого животного целесообразно готовить 2—3 образца разведенной крови. В пробирку вносят 0,4 мл 3 или 5 %-ного раствора уксусной кислоты, подкрашенного метиленовым синим (жидкость Тюрка). Капиллярной пипеткой набирают 0,02 мл крови, конец пипетки тщательно протирают вначале увлажненной, а затем сухой ватой или марлей. Переносят кровь в пробирку, осторожно выдувая. Пипетку ополаскивают жидкостью Тюрка. Кровь в пробирке тщательно перемешивают, закрывают и оставляют стоять на 4 мин, периодически перемешивая содержимое.

Счетную камеру предварительно тщательно обезжиривают спиртом, промывают дистиллированной водой и высушивают под феном, протирают мягкой фланелью.

Подсчитывают лейкоциты в 100 больших (1600 малых) квадратах.

Расчет. Подсчитанное в 100 больших квадратах число клеток умножают на 50 (разведение крови 1 : 20), получают окончательный результат в тысячах в 1 мкл. Для подсчета клеток в 1 л количество лейкоцитов в 1 мкл умножают на 1000 (10 /л).

При подсчете лейкоцитов в камере соблюдают все те же правила, которые изложены в методике подсчета эритроцитов. Ошибка при подсчете составляет в среднем +7 %.

Наиболее вероятные источники ошибок — травмирование тканей ушной раковины при выжимании, выдавливании крови; неравномерное перемешивание крови; не очень чистый микрокапилляр и др. Каждый лабораторный работник должен выявить собственную ошибку путем многократных анализов одной и той же пробы, включая взятие крови.

Клиническое значение определения в крови эритроцитов и лейкоцитов. Родоначальной клеткой для всех форменных элементов крови является стволовая клетка, которая дает начало общей клетке — предшественника миелопоэза и общей клетке — предшественника лимфопоэза. Из клетки — предшественника миелопоэза в миелоидной системе (костный мозг), проходя определенные стадии дифференцировки, образуются эритроциты, тромбоциты, моноциты и зернистые лейкоциты. Из клетки — предшественника лимфопоэза в лимфоидной системе образуются лимфоциты: Т-лимфоциты — клетки, обеспечивающие реакции клеточного иммунитета и В-лимфоциты — клетки, обеспечивающие реакции гуморального иммунитета.

Кровь здоровых животных содержит зрелые клетки: эритроциты, тромбоциты, лейкоциты (базофилы, эозинофилы, палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы, лимфоциты, моноциты) и тучные клетки (цвет. рис. I—VII). Появление незрелых промежуточных клеток миелопоэза (ретикулоцитов, нормоцитов, эритро- бластов, миелобластов, миелоцитов и др.) и лимфопоэза (плазмо- бластов, пролимфоцитов, лимфобластов и др.) свидетельствует о развитии патологии кроветворения.

Эритроциты — мелкие клетки крови, содержащие гемоглобин, благодаря чему способны переносить кислород от легких к тканям и углекислый газ от тканей к легким. Зрелые эритроциты млекопитающих — безъядерные клетки, имеют форму двояковогнутого диска. Эритроциты птиц и низших позвоночных — ядерные клетки элипсовидной формы.

В нефиксированном (нативном) препарате эритроциты выглядят как желтоватые округлые образования. В фиксированных и окрашенных мазках крови они обнаруживаются как круглые клетки розового или серовато-розового цвета с просветлением в центре.

Тромбоциты — кровяные пластинки. Это мелкие, безъядерные клетки крови диаметром 5 мкм в количестве от 200 до 900 тыс/мкл, участвуют в свертывании крови. В окрашенных мазках крови они выглядят как мелкие круглые или овальные образования. При снижении их числа наблюдается кровоточивость, развивается гемофилия.

Лейкоциты — разнообразные по морфологическим признакам и функциям клетки сосудистой системы крови. Они выполняют функции защиты организма путем фагоцитарной активности и участия в формировании гуморального иммунитета, в восстановительном процессе при тканевом повреждении. Лейкоциты, в цитоплазме которых содержится специфическая зернистость, называются зернистыми, или гранулоцитами. К ним относятся нейтрофилы (палочкоядерные, сегментоядерные и юные), эозинофилы и базофилы. Незернистые лейкоциты (агранулоциты) характеризу

ются отсутствием специфической зернистости в цитоплазме и несегментированными ядрами. В группе агранулоцитов выделяют два вида — лимфоциты и моноциты.

Содержание эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов у взрослых животных в норме приведено в таблице 4.

4. Содержание эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов у животных

Уменьшение количества эритроцитов — эритроцитопения (олиго- цитемия) встречается при длительном недокорме животных, пост- геморрагической, гемолитической, железодефицитной, гипоплас- тической анемиях, В12 (фолиево)-дефицитной анемии, лейкозах, злокачественных новообразованиях. Олигоцитемия развивается при инфекционной анемии лошадей, гематурии крупного рогатого скота, пироплазмозе, нутталиозе, трипанозомозе, многих острых и хронических инфекционных и инвазионных болезнях, гепатите и гепатозе, хроническом нефрите.

Увеличение количества эритроцитов (полицитемия, эритроци- тоз) встречается при сильной диарее вследствие сгущения крови, при обильном потоотделении, непроходимости тонкого кишечника, сильной мышечной нагрузке.

Нахождение животных на высоте 1400—2000 м и выше над уровнем моря сопровождается повышением содержания эритроцитов в крови.

Увеличение количества лейкоцитов (лейкоцитоз) бывает патологическое и физиологическое. Патологический лейкоцитоз отмечается при гнойно-воспалительных процессах, сопровождающих пневмонию, бронхопневмонию, плеврит, перикардит, ретикулопе- ритонит, перитонит, абсцессы печени, эндометрит и многие другие болезни. Выраженный лейкоцитоз наблюдается при ряде инфекционных болезней, хирургической инфекции, лейкозах, лимфогранулематозе. Лейкоцитоз возникает при отравлениях мышьяком, ртутью, укусах ядовитых насекомых, змей. Увеличение количества лейкоцитов может быть в результате введения больших доз камфоры, калия йодида, белковых препаратов, вакцин, сывороток.

Физиологический умеренный лейкоцитоз бывает при беременности, после физических нагрузок, приема богатой белком пищи (у плотоядных), стрессах.

Уменьшение количества лейкоцитов (лейкоцитопения, лейкопения) может быть результатом угнетения кроветворных органов, истощения их, пониженной реактивности организма; лейкопению отмечают при вирусных болезнях, циррозе печени, поражении селезенки, действии ионизирующей радиации, ряда химических веществ и лекарственных препаратов. Смена лейкоцитоза лейкопенией при воспалительных и гнойно-септических заболеваниях служит показателем понижения резистентности организма, угнетения кроветворения, ухудшения состояния больного животного.

Течение заболеваний, для которых характерна лейкоцитопения, наблюдается у ослабленных, истощенных животных. Лейкоцитопения может быть следствием длительного введения в организм больших доз сульфаниламидов, амидопирина, левомицетина, синтомицина, препаратов ртути, мышьяка, висмута. Она отмечается при алейкемической форме лейкоза, отравлениях ДЦТ и некоторыми другими ядами.

Дифференциальный подсчет лейкоцитов (лейкотрамма). Проводят визуальную микроскопическую оценку сухих фиксированных окрашенных мазков крови с дифференцированным подсчетом лейкоцитов и описанием морфологии эритроцитов.

Лейкограмма выражается как процентное соотношение между отдельными видами лейкоцитов крови.

Морфологическое исследование мазков крови включает следующие этапы: подготовку стекол, приготовление, фиксацию, микроскопическую и морфологическую оценку мазков.

Подготовка пре дметных стекол. Предметные стекла должны быть чистыми, обезжиренными и сухими. Бывшие в употреблении или новые стекла замачивают в эмалированной посуде в стиральном порошке. Старый мазок удаляют ватным тампоном и стекла кипятят в том же растворе 10—15 мин, затем их промывают в проточной воде, насухо протирают и помещают на 30—60 мин в смесь Никифорова (этиловый спирт 9б°%-ный и диэтиловый эфир в соотношении 1:1), после чего протирают насухо чистой тканью и помещают на хранение в посуду с крышкой.

Примечания. 1. Длительное кипячение (более 10 мин) предметных стекол и кипячение их в алюминиевой посуде приводит к помутнению стекол. 2. Полноту отмывки от щелочных средств проверяют качественной реакцией с 0,1%-ным спиртовым раствором фенолфталеина, путем нанесения 2—3 капель на чистое стекло. Появление розового окрашивания свидетельствует о плохой промывке стекол.

Приготовление мазков. Мазки крови готовят на предварительно подготовленных обезжиренных предметных стеклах. Берут за ребра (а не за поверхность) предметное стекло и, отступая 1,5—2 см от узкого конца, наносят на него небольшую каплю крови. Шлифовальным стеклом, которое несколько уже, чем предметное, на которое нанесена капля крови, размазывают последнюю. Для этого шлифовальное стекло узким краем ставят под углом 45° слева от капли, слегка подвигают его вправо, чтобы провести с ней соприкосновение, выжидают, пока капля расплывется по всему ребру, и легким быстрым движением ведут стекло справа налево, пока капля будет исчерпана.

При медленном размазывании ухудшается равномерность распределения форменных элементов в мазке. При нажимании стеклом на стекло многие клетки повреждаются. Если угол между стеклами меньше 45°, то большее количество клеток скапливается в конце мазка. Величина капли должна быть соразмерна тому, чтобы весь мазок помещался на стекле, не доходя 1—1,5 см до его конца. Мазок должен иметь желтоватый цвет. Густо-розоватые и красноватые мазки не пригодны для счета, так как лейкоциты в них деформированы, а эритроциты лежат один на другом. Если была взята слишком большая капля, то после того как она распределилась по ребру шлифованного стекла, последнее приподнимают, переносят на несколько миллиметров влево, вновь ставят на предметное стекло и отсюда начинают делать мазок. Мазок тотчас сушат на воздухе. На сухом мазке по его середине иглой пишут номер или кличку животного, при необходимости и дату взятия крови.

Фиксация мазков. Фиксирующая жидкость вызывает коагуляцию белка и прикрепляет клетку к стеклу. Фиксация придает форменным элементам крови стойкость по отношению к содержащейся в краске воде и препятствует деформации эритроцитов и лейкоцитов.

Реактивы: метиловый спирт (х. ч.) или эозин метиленовый синий по Май-Грюнвальду (раствор), или этиловый спирт 96%-ный.

Оборудование: штатив для сушки мазков; пинцет; широкогорлая банка с притертой пробкой или крышкой.

Ход определения. Высохшие на воздухе мазки опускают в широкогорлую банку с крышкой, выдерживают в фиксаторе 5—10 мин, затем извлекают пинцетом и высушивают на воздухе. В этиловом спирте мазки выдерживают не менее 35 мин.

Для фиксации и последующей обработки необходимо отбирать правильно приготовленные тонкие мазки (мазок должен быть желтого цвета, отступать от края широких сторон предметного стекла на 1—3 мм и заканчиваться «метелочкой», не доходя 1,5—2 см до левого узкого края).

Окраска мазков. Оборудование: контейнеры для окраски мазков с кюветами или «рельсы» стеклянные с эмалированными лотками; пинцет; цилиндры или стаканы градуированные; палочки стеклянные; стаканчики химические; бутылки с притертыми пробками.

В строго нейтральной среде структурные элементы клеток крови в азур-эозиновой смеси окрашиваются в различные цвета: щелочные компоненты клетки (цитоплазма) — эозином в розово-красный цвет; кислые (РНК в ядрышках и цитоплазме, ДНК в ядре) — основными красителями в голубовато-синие цвета. Для приготовления красителей и смывания их с мазков используют воду нейтральной реакции. Вода кислой реакции ослабляет действие щелочного элемента красителя (азура II), вследствие чего лейкоциты плохо окрашиваются. Мазки имеют красный цвет за счет красной окраски эритроцитов и ядер лейкоцитов. Вода щелочной реакции ослабляет действие кислого компонента красителя (эозина), поэтому эритроциты окрашиваются в серовато-синий цвет, а ядра лейкоцитов — в очень темные цвета. Для подщелачивания и доведения реакции воды до нейтральной к ней по каплям прибавляют 1%-ный раствор натрия двууглекислого. Щелочную воду нейтрализуют 1%-ным раствором уксусной кислоты. Можно брать дистиллированную и водопроводную воду в различных сочетаниях.

Реакцию воды можно определить с помощью рН-метра или гематоксилина. При использовании гематоксилина к 10 мл дистиллированной воды прибавляют 2—3 капли свежеприготовленного спиртового раствора гематоксилина. Вода нейтральной реакции окрашивается в бледно-фиолетовый цвет не ранее чем через 1 мин и не позднее чем через 5 мин. Если вода окрасилась раньше чем через 1 мин, значит, она щелочная, а если позднее чем через 5 мин, — кислая.

Окраска по Нохту. Реактивы:

1. основные растворы красителей — азур II, 1 г/л (1,0 г азура II растворяют в 1000 мл дистиллированной воды) и эозин калия,

1. г/л (1,0 г эозина калия растворяют в 1000 мл дистиллированной воды). Растворы готовы к употреблению через 14 дней со дня приготовления, хранят их в посуде темного стекла с притертой пробкой при комнатной температуре;

2. фосфатный буфер или смесь Вейзе (pH 7,4—7,5): калия фосфат однозамещенный безводный (КН2Р04) 0,49 г, натрия фосфат двузамещенный (ЫагНРС^ х 2НгО) 1,14 г или безводный (№2НР04) 0,909 г, дистиллированная вода 1000 мл.

Рабочий раствор готовят перед употреблением, смешивая 25 мл основного раствора азура II, 20 мл основного раствора эозина калия и 55 мл буферного раствора. Пропорции красителей могут несколько варьировать и должны быть установлены опытным путем при приготовлении свежей порции основных растворов красителей.

Фиксированные сухие мазки помещают в контейнер, который опускают в кювету с рабочим раствором красителя и выдерживают в нем строго определенное время, подобранное для каждой партии краски, — от 20 до 45 мин. Затем контейнер переносят в кювету с водопроводной водой. После этого мазки ставят вертикально в штатив для сушки.

При отсутствии штатива-контейнера высушенные мазки можно красить на «рельсах», заливая мазок рабочим раствором красителя возможно более высоким слоем (2—3 мл на мазок).

Окраска по Паппенгейму. Реактивы: 1) эозин метиленовый синий по Май-Грюнвальду (раствор). При отсутствии заводского раствора готовят 5 г/л раствора сухого красителя в метиловом спирте (х. ч.). Раствор готов к употреблению через 4 дня; 2) рабочий раствор азур-эозина по Нохту.

Сухие нефиксированные мазки помещают в контейнер и опускают в кювету с раствором красителя-фиксатора Май-Грюнвальда на 5 мин. Затем контейнер с мазками ополаскивают в кювете с дистиллированной водой и помещают к кювету с рабочим раствором азур-эозина по Нохту на 8—15 мин. Смывают краску, переносят контейнер в кювету с дистиллированной водой. Мазки высушивают на воздухе.

Окраска по Романовскому—Гите. Реактивы: 1) готовый заводской краситель Романовского—Гимзы (азур-эозиновая смесь);

2. рабочий раствор — 2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Готовят его перед употреблением.

Фиксированные мазки в кювете заливают рабочим раствором красителя Романовского—Гимзы и выдерживают 15—30 мин. Затем мазки промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Продолжительность окраски зависит от качества красителя и температуры воздуха. Чем ниже температура воздуха, тем продолжительнее окраска. Выбор оптимального времени окраски проводят всякий раз, когда начинают использовать новый флакон заводского красителя. Хорошо окрашенные мазки имеют розово-фиолетовый цвет, недоокрашенные — розовато-красноватый, перекрашенные — темно-фиолетовый.

Микроскопическое исследование мазков крови. Реактивы: иммерсионное масло; диэтиловый эфир или этиловый спирт.

Оборудование: микроскоп; осветитель для микроскопа; 11-клавишный счетчик для выведения лейкоцитарной формулы; капельница.

Просматривают мазок крови под малым увеличением микроскопа (объектив х 10, окуляр х7). Подсчет лейкоцитов и оценка морфологии эритроцитов допустимы только в тонкой части мазка, где эритроциты лежат одиночно, а не сложены в «монетные столбики».

На край мазка помещают каплю иммерсионного масла, переводят на иммерсионный объектив (х90). Лейкоциты подсчитывают по зигзагу (по линии «Меандра»), отступя 2—3 поля зрения от верхнего края мазка, в начале в 3—5 полях зрения вдоль края мазка, затем в 3—5 полях зрения под прямым углом к середине мазка, потом в 3—5 полях зрения параллельно краю мазка и вновь под углом 90° возвращаются к краю мазка. Такое движение продолжают до тех пор, пока не будет сосчитана половина клеток, необходимая для выведения лейкограммы. Затем переходят на противоположную сторону мазка и подсчитывают вторую половину клеток. Подсчитывают только целые (неразрушенные) клетки.

В норме в крови выявляются лейкоциты следующих форм: базофилы, эозинофилы, нейтрофилы палочкоядерные и сегментоядерные, лимфоциты, моноциты. При наличии в мазках крови плазматических клеток, незрелых, бластных и труднодифференцируемых форм лейкоцитов их также вводят в лейкограмму, описывают их морфологию.

Одновременно с выведением лейкограммы оценивают морфологию лейкоцитов. Если в анализе крови не было выявлено отклонений от нормы количественного состава форменных элементов крови, а при подсчете 100 лейкоцитов не обнаружено никаких отклонений от нормы ни в лейкограмме, ни в морфологии лейкоцитов, то можно ограничиться подсчетом 100 клеток. Если при этом были выявлены какие-либо отклонения от нормы, то необходимо подсчитывать не менее 200 лейкоцитов.

Лейкограмма дает представление только об относительных величинах. Более объективное представление о составе лейкоцитов крови дает вычисление их абсолютного количества, т. е. содержание каждого вида лейкоцитов в определенном объеме крови.

Для подсчета эритроцитов и лейкоцитов крови, их дифферен- цировки можно пользоваться поточными автоматическими гематологическими цитометрами. Эти приборы позволяют определять гематокрит; количество эритроцитов; рассчитать среднее содержание гемоглобина в эритроците, т. е. отношение концентрации гемоглобина (г/л) к числу эритроцитов крови (МСН); среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците, т. е. отношение концентрации гемоглобина (г/л) к величине гематокрита (л/л) (МСНС); выделить различные группы клеточных элементов, отличающихся не только по размеру, но и по зернистости. Анализаторы типа БТКБ позволяют подсчитать общее количество лейкоцитов и построить их гистограмму, выделить лимфоциты, моноциты, эозинофилы, гра- нулоциты, а также нетипичные клетки (ядерные эритроциты, сгустки тромбоцитов, лимфобластов, гранулоцитов).

Различные фирмы выпускают автоматические гематологические анализаторы: Н6000, Н1 и Н2 (фирма «Technicon»), STKS («Coulter»), NE 8000 («TOA»), «Sysmex», Cell-Dyn 3000 («Abbott»), Codas Argoss 5DifF («Roche») и др.

Подсчет количества лейкоцитов требует применения в качестве антикоагулянта этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилона В), так как гепарин может интерферировать с лизирующими клетками реагента.

Клиническое значение показателей лейко- граммы. Процесс образования, развития и созревания клеток крови (гемопоэз — кроветворение) у человека и животных происходит в костном мозге, селезенке и в лимфатических узлах. В костном мозге образуются эритроциты, тромбоциты, моноциты и зернистые лейкоциты (базофилы, сегментоядерные нейтрофилы); в лимфатических узлах и селезенке — лимфоциты.

При анализе лейкограммы учитывают количество зрелых клеток: базофилов, эозинофилов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов. При ряде патологических состояний дают оценку незрелых, молодых форм эритроцитов и лейкоцитов (лимфобластов, промегакариоцитов, мегакариоци- тов, нормобластов, промиелоцитов, миелоцитов, мета-миелоцитов, пролимфоцитов).

Форменные элементы крови здоровых животных различных видов приведены на цветных рисунках I—IV. Нормальные величины количества различных видов лейкоцитов крови у взрослых здоровых животных представлены в таблице 5.

При оценке результатов исследования лейкоцитов учитывают общее их количество, наличие ядерного сдвига нейтрофилов, процентное соотношение лейкоцитов отдельных видов, наличие или отсутствие дегенеративных изменений в клетках.

5. Содержание лейкоцитов в крови здоровых животных различных видов (лейкограмма), %

Появление в лейкограмме молодых и дегенеративных форм нейтрофилов (ядерный сдвиг нейтрофилов) — характерный признак, свойственный инфекционным и воспалительным процессам, злокачественным новообразованиям, различного рода интоксикациям. Различают регенеративный, дегенеративный и лейкемоид- ный ядерные сдвиги. При регенеративном сдвиге увеличивается содержание палочкоядерных и юных нейтрофилов, при дегенеративном — только палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов наряду с дегенеративными изменениями в клетках. Лейкемо- идный сдвиг характеризуется появлением более незрелых форм (миелоцитов, промиелоцитов, миелобластов и др.).

Регенеративный сдвиг наблюдается главным образом при воспалительных и гнойно-септических процессах. Дегенеративный сдвиг — показатель функционального угнетения костного мозга, встречается при интоксикациях (сальмонеллез, острый перитонит, уремическая и диабетическая кома). Лейкемоидные сдвиги являются обычно отражением своеобразной реактивности больного организма при самых различных заболеваниях.

Базофилы — клетки крови диаметром 8—14 мкм, в цитоплазме их имеются крупные базофильные гранулы, содержащие гепарин. Ядро базофилов крупное сегментированное, окрашивается в фиолетово-розовый цвет. Они участвуют в иммунологических реакциях аллергического типа и процессах свертывания крови. В крови встречаются в небольшом количестве.

Увеличение содержания базофилов наблюдается при хроническом миелолейкозе, гипофункции щитовидной железы. Уменьшение содержания базофилов учесть трудно из-за малого их количества в крови.

Эозинофилы — клетки крови размером 8—20 мкм. Отличаются обильной крупной розовой зернистостью, заполняющей всю цитоплазму. Обладают некоторой фагоцитарной и двигательной активностью, участвуют в аллергических реакциях.

Эозинофилия — увеличение содержания эозинофилов. Наблюдают при паразитарных заболеваниях (трихинеллезе, описторхозе, аскаридозе, эхинококкозе и др.), ревматизме, хроническом миелолейкозе, лимфогранулематозе и других злокачественных новообразованиях, ожоговой болезни, обморожении. Появление эозинофилов при воспалительных и гнойно-септических процессах на фоне лимфоцитоза и незначительного ядерного сдвига нейтрофилов является предвестником благоприятного исхода заболевания.

Эозинопения — уменьшение содержания эозинофилов. Отмечают при сепсисе, тяжелых интоксикациях, в агональном состоянии.

Нейтрофилы (палочкоядерные и сегментоядерные) — лейкоцитарные клетки размером 7—15 мкм, обладающие выраженной защитной функцией, связанной с их фагоцитарной и двигательной активностью, способностью вырабатывать бактерицидные (лизо- цим) и антитоксические вещества. Отличительный признак нейтрофилов — мелкая зернистость в цитоплазме. Ядро у молодых клеток не сегментировано и напоминает изогнутую 8-образной формы палочку (палочкоядерные нейтрофилы). В процессе созревания клеток ядро как бы перекручивается, образуя сегменты, соединенные тонкими нитями хроматина (сегментоядерные нейтрофилы). В окрашенных мазках крови цитоплазма нейтрофилов розово-серого цвета (слабооксифильная). Мелкая зернистость в цитоплазме у собак, кошек и свиней окрашивается в розово-фиолетовый цвет, у лошадей и жвачных она воспринимает кислые и основные красители.

Нейтрофилез (нейтрофилия) — увеличение содержания нейтрофилов (палочкоядерных, сегментоядерных). Отмечают при воспалительных процессах (пневмония, перитонит, пиелонефрит, септицемия, плеврит и др.), интоксикациях. Выраженный нейтро- фильный лейкоцитоз с обнаружением молодых форм нейтрофилов, вплоть до промиелоцитов и миелобластов (сдвиг ядра влево), наблюдается при острых пневмониях, тяжелых инфекциях, остром гемолизе. Появление в крови незрелых нейтрофилов (миелоцитов, промиелоцитов, миелобластов) отмечается при миелолейкозе и других злокачественных поражениях (гемобластозах).

Нейтропения — снижение содержания в крови нейтрофилов. Признак падения сопротивляемости организма к инфекциям, воздействия на организм ионизирующей радиации, цитостатических препаратов. Нейтропения обычно совпадает с лейкопенией.

Лимфоциты — клетки крови диаметром от 4,5 до 18 мкм с округлым или овальным ядром, окрашенным в светло-синий или голубой цвет, цитоплазмой с видимым перинуклеарным просветлением (характерный признак). Различают малые, средние и большие лимфоциты. По иммунологическим функциям выделяют Т- и В-лимфоциты.

Лимфоцитоз — увеличение содержания лимфоцитов. Характерный признак хронического лимфолейкоза. Незначительный лимфоцитоз бывает при пневмонии, роже свиней, остеомиелите, сепсисе и некоторых других болезнях и указывает на фазу выздоровления. Лимфоцитоз при агранулоцитозе или лимфатической лейкемоидной реакции — неблагоприятный признак, свидетельствующий о снижении микрофагоцитарной функции организма вследствие истощения гранулопоэза.

Лимфоцитопения — уменьшение содержания лимфоцитов. Встречают при некоторых тяжелых инфекциях, воспалительных и гнойно-септических заболеваниях, и в прогностическом отношении она является неблагоприятным симптомом.

Моноциты — самые крупные клетки (диаметр 10—20 мкм) нормальной крови с круглым ядром бобовидной или подковообразной формы. В патологических случаях ядро может быть сегментировано. Структура ядра нежная сетчатая, в окрашенных мазках бледно-фиолетового цвета, может содержать мелкую зернистость, ва

куоли, зерна пигмента и др. Моноциты фагоцитируют микробные тела, клеточные остатки, различные токсические продукты.

Моноцитоз — увеличение содержания моноцитов. Наблюдают при острых инфекционных заболеваниях, а также при туберкулезе, бруцеллезе, злокачественных опухолях и сепсисе.

Моноцитопения — уменьшение количества моноцитов. Бывает при тяжелых септических процессах и некоторых инфекционных болезнях.

Определение гематокрита с помощью микроцентрифуги. Оборудование: микроцентрифуга МЦГ-8; капиллярные трубки, имеющиеся в комплекте центрифуги (можно использовать капилляры для определения С-реактивного белка). Используют капиллярную или венозную кровь с ЭДТА или гепарином.

Ход определения. При взятии крови непосредственно от животного для предотвращения ее свертывания капилляры обрабатывают антикоагулянтом и высушивают. Если используют кровь с антикоагулянтом, то этого не делают. Заполняют капилляры на 7/8 длины кровью, закупоривают их с одного конца пластилином и помещают в ротор центрифуги так, чтобы закупоренные концы упирались в резиновую прокладку. Центрифугируют 5 мин при 8000 мин *. Определяют гематокритную величину по отсчетной шкале, приложенной к центрифуге.

Определение гематокрита с использованием пипеток Панченкова или градуированных. Оборудование: центрифуга; пипетки Панченкова или другие градуированные микропипетки.

Ход определения. В обработанную антикоагулянтом (или необработанную) пипетку Панченкова с отрезанным верхним концом набирают кровь точно до верхней метки, закупоривают ее, обтягивая резиновым кольцом, и центрифугируют 30 мин при 3000 мин . Для каждой центрифуги устанавливают определенное время работы. Вычитают из 100 высоту столбика эритроцитов и получают гематокритную величину в процентах.

Подобным методом определяют гематокрит в пипетках или пробирках иного типа.

Нормальные величины гематокрита у взрослых животных указаны в приложениях 6 и 7. У молодняка гематокрит ниже, чем у взрослых животных, и имеет некоторую возрастную динамику.

Клиническое значение. Гематокрит — соотношение объема плазмы и форменных элементов крови, выраженное в процентах по объему. Увеличение гематокритной величины отмечают при анемиях и кровопотерях, уменьшение — при сгущении крови. Для объективной оценки лабораторных показателей крови определение гематокрита обязательно.

Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) микрометодом Панченкова. Принцип метода основан на использовании свойств крови, смешанной с раствором цитрата натрия, не свертываться при стоянии, а разделяться на два слоя: нижний — эритроциты и верхний — плазму. Это расслоение происходит с различной скоростью в зависимости от изменения химических и физических свойств крови.

Р е а к т и »: 1,5%-ный раствор натрия цитрата трехзамещен- ного пятиводного. Раствор фильтруют, pH раствора нейтральный или слабощелочной. Реактив нестойкий, при помутнении раствор необходимо заменить.

Оборудование: пробирки размером 10 • 1 см; аппарат Панченкова, состоящий из штатива с гнездами и зажимами для специальных капиллярных пипеток с просветом канала 1 мм. На пипетках нанесена миллиметровая шкала длиной 10 см. Верхнее деление шкалы отмечено «0» и буквой «К» (кровь). Через каждые 10 делений стоят цифры 10, 20, 30 и т. д. до 100; против деления 50 — буква «Р» (реактив). Отверстия концов капиллярных пипеток, вставленных в прибор, герметически закрываются резиновыми прокладками или пробками, и кровь из пипетки не выливается. Капиллярные пипетки и пробирки должны быть хорошо промыты хромовой смесью.

Ход определения. В капиллярную пипетку, предварительно промытую раствором цитрата натрия, набирают этот раствор до метки «Р» и вводят в пробирки размером 10 • 1 см. Затем тем же капилляром набирают 2 раза кровь из ушной вены до метки «К» и вносят ее каждый раз в ту же пробирку. Хорошо смешивают, насасывают в капилляр до метки «0» и, заметив время, ставят в штатив. Через 1 ч отсчитывают по делениям капиллярной пипетки величину оставшегося столбика плазмы.

Расчет. Скорость оседания определяют за 1 ч. Для определения скорости оседания эритроцитов, гематокрита предложено несколько видов устройств. Фирма «Diesse Diagnostica Senese» (Италия) предлагает Vesmatic System — устройство одновременного определения СОЭ в 60 пробах по 1 мкл крови, содержащихся в пластиковых вакуумных пробирках VACUTEG. Фирма «Invitech Ltd» (Англия) выпускает прибор ESRPLUS, который способен определять одновременно в трех пробах капиллярной крови объемом

25. мкл каждая СОЭ, гематокрит, содержание общего билирубина, а также оценивать наличие липемии и гемолиза. Во всех случаях свежую капиллярную кровь исследуют непосредственно после взятия, венозную стабильную — в течение 12 ч при 2—8 °С.

Клиническое значение. Склеиванию эритроцитов крови препятствует их отрицательный заряд, вследствие чего они отталкиваются друг от друга. Ускорению оседания эритроцитов способствуют глобулины, фибриноген, мукополисахариды, содержание которых увеличивается при многих воспалительных процессах, инфекциях, злокачественных опухолях, нефрите и др.

При вертикальном положении пипетки Панченкова у здоровых животных СОЭ равна (мм/ч): крупный рогатый скот 0,5—1,5; овцы, козы 0,5—1,0; лошади 40—70; свиньи 2—9; собаки 2—6; куры 2—3.

Замедление СОЭ отмечается при диарее (тяжелой форме диспепсии молодняка), обильном потении, полиурии, механической и паренхиматозной желтухах, непроходимостях кишечника. Повышение СОЭ наблюдается при большинстве воспалительных процессов, инфекциях, злокачественных опухолях, коллагенозах, нефрите, анемиях.

Определение гемоглобина крови гемиглобинцианидиым методом. Принцип. Гемоглобин при взаимодействии с железосинеродистым калием окисляется в метгемоглобин (гемиглобин), образующий с ацетонциангидрином окрашенный гемиглобинцианид, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию гемоглобина. Кровь с антикоагулянтом хранят в течение 24 ч при

2. 8 “С, 8 ч при комнатной температуре — 15—20 °С.

Реактивы: заводской набор реактивов;

трансформирующий раствор (ацетонциангидрин 0,5 мл, калий железосинеродистый 200 мг, натрий двууглекислый 1 г, дистиллированная вода до 1л); стабилен при хранении в посуде из темного стекла в течение 3 мес, при появлении осадка или обесцвечивании раствор к употреблению не пригоден;

стандартный раствор гемиглобинцианида, соответствующий концентрации гемоглобина крови 15 г% при разведении крови в 251 раз.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; пипетки на 0,02 мл; колба мерная на 1 л.

Ход определения. В пробирку вносят 5 мл трансформирующего раствора и 0,02 мл крови (разведение в 251 раз), хорошо перемешивают, оставляют на 10 мин, после чего смесь измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы (трансформирующий раствор). Стандартный раствор измеряют при тех же условиях, что и опытную пробу.

Расчет гемоглобина (г%)проводят по формуле НЬ = Еоп/Ест х 15,

где ?0п — экстинкция опытной пробы; ^ет — экстинкция стандартного раствора; 15 — соответствие стандартного раствора концентрации гемоглобина крови при ее разведении в 251 раз.

Для перевода г% в г/л найденное число умножают на 10.

Метод Сали, предложенный еще в 1895 г., неточен и им в настоящее время пользоваться не рекомендуется.

Определение гемоглобина в крови возможно с помощью бумажных полосок, помещенных на пластиковых подложках в отражательные фотометры, выпускаемых фирмами «Эймс» (США) и др. Исследуемую пробу наносят на реакционную зону диагностической полоски и помещают в прибор, в котором она облучается полихроматическим светом, диффузионно отраженный свет собирается на измерительной системе и после прохождения через интерферирую

щий фильтр измеряется, затем его сравнивают со стандартом. Система контролируется микропроцессором.

Клиническое значение. Гемоглобин — дыхательный пигмент крови, состоит из белка глобина и простетической группы — гема. Глобин по строению близок к альбумину, синтезируется в печени, представляет хелатный комплекс протопарферина с двухвалентным железом.

Основная функция гемоглобина — перенос кислорода от легких к тканям. Гемоглобин участвует в транспорте углекислого газа из тканей в легкие, в поддержании кислотно-основного равновесия в организме, т. е. обладает буферными свойствами. Он способен соединяться с оксидом углерода, образуя карбоксигемоглобин, а также с некоторыми химическими веществами с образованием метге- моглобина. Эти соединения не способны переносить кислород от легких к тканям.

Нормативы содержания гемоглобина у животных приведены в приложениях 5—7.

Снижение количества гемоглобина отмечается при дефицитных анемиях вследствие недостатка железа, меди, кобальта, витамина В12, фолиевой кислоты, белков и других веществ, при хронических интоксикациях, гепатите, гепатозе и других болезнях печени, кето- зе, расстройствах желудочно-кишечного тракта, инфекционных и инвазионных болезнях и других заболеваниях. Умеренное снижение гемоглобина отмечают при алиментарной (железодефицитной) анемии, более выраженное — при массовой кровопотере, гемолитической и гипопластической анемии.

Следует отметить, что снижение концентрации гемоглобина и количества эритроцитов не всегда протекает параллельно. Чаще количество гемоглобина уменьшается резче, чем число эритроцитов в крови. Однако при ряде заболеваний могут возникать противоположные сдвиги, поэтому необходимо одновременно определять цветовой показатель.

Повышение уровня гемоглобина отмечают при сгущении крови (диарея, обильное потоотделение), непроходимости кишечника, сильной мышечной нагрузке, нахождении животных на высоте 1400 м и выше над уровнем моря.

Определение цветового (цветного) показателя. Цветовой показатель — среднее содержание гемоглобина в одном эритроците. Он характеризует степень насыщения эритроцитов гемоглобином по сравнению с нормой. Цветовой показатель вычисляют путем деления концентрации гемоглобина в 1 мкл крови, выраженной в пикограммах (пк), на число эритроцитов в том же объеме крови.

Цветовой показатель определяют по формуле

х =              ЗНв (г/л)             

Три первые цифры количества эритроцитов в 1 мкл'

Например, в 1 мкл крови содержится 4 500 ООО эритроцитов, концентрация гемоглобина 120 г/л. В этом случае цветовой показатель будет равен 3 • 120/450 = 0,8.

В норме цветовой показатель равен 1 или близок к ней. Снижение его до 0,8 и ниже (гипохромия) свидетельствует о слабом насыщении эритроцитов гемоглобином, что отмечается при железодефицитной анемии. Увеличение цветового показателя выше 1 (гиперхромия) отмечается при В^- и фолиеводефицитных, ги- попластических анемиях. При острых кровотечениях, хронических лейкозах, некоторых гемолитических анемиях отмечается нор- мохромная анемия, при которой цветовой показатель близок к 1.