Определение белковых фракций в сыворотке крови. 

Из электрофоретических методов предпочтение отдается электрофорезу на пленках из ацетата целлюлозы и электрофорезу на бумаге.

Определение альбумина в сыворотке крови по реакции с бром- крезоловым зеленым. Принцип. При взаимодействии альбумина с бромкрезоловым зеленым в слабокислой среде в присутствии детергента образуется окрашенный комплекс синего цвета.

Реактивы: уксусная кислота, 1 моль/л. В мерную колбу вместимостью 1 л вносят 60 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем до метки;

натрия гидроксид (ч. д. а., х. ч.), 1 моль/л; полиоксиэтиленлауриловый эфир (бридж 35); ацетатный буфер, 0,05 моль/л, pH 4,2 с добавлением детергента. 0,85 г бриджа 35 растворяют в 200 мл воды, добавляют 50 мл 1 моль/л раствора уксусной кислоты, 13,2 мл 1 моль/л раствора натрия гидроксида и доводят объем водой до 1 л. Перемешивают, проверяют pH. Реактив стабилен при хранении в холодильнике;

бромкреозоловый зеленый (БКЗ) водорастворимый индикатор (ч. д. а.). 1,2 ммоль/л. 0,4292 БКЗ растворяют в 200 мл воды в мерной колбе вместимостью 500 мл и доводят объем до метки. Стабилен при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла;

рабочий раствор БКЗ в ацетатном буфере. В мерную колбу вместимостью 1 л вносят 85 мл 1,2 ммоль/л раствора БКЗ, доводят объем до метки ацетатным буфером с детергентом. Стабилен при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла;

основной калибровочный раствор альбумина, 10 г на 100 мл.

Оборудование: фотоэлектроколориметр (ФЭК) или спектрофотометр.

Ход определения. 10 мкл сыворотки крови (или 0,1 мл сыворотки, разведенной в 10 раз 0,9%-ным раствором ГЧаС1) тщательно перемешивают, избегая образования пены, с 4 мл рабочего раствора БКЗ в ацетатном буфере. Через 5—10 мин измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 630—690 нм (красный светофильтр) против холостой пробы на реактивы или на спектрофотометре при длине волны 625 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Окраска стабильна в течение 8 ч.

Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо сыворотки добавляют 0,1 мл воды.

Расчет ведут по калибровочной кривой. Построение калибровочной кривой: готовят ряд разведений основного калибровочного раствора, как указано в таблице 12. Калибровочные растворы обрабатывают так же, как и опытные, но вместо сыворотки добавляют 10 мкл калибровочного раствора. Калибровочная кривая линейна до концентрации альбумина 60 г/л.

12. Приготовление разведений основного калибровочного раствора

Источники: 43, 45.

Определение иммуноглобулинов в сыворотке крови по реакции с натрия сульфитом.

Реактив: 18%-ный раствор натрия сульфита (№2803, ч. д. а., х. ч.). 18 г вещества растворяют в 82 мл дистиллированной прокипяченной воды.

Оборудование: фотоэлектроколориметр.

Ход определения. В две пробирки вносят по 3,8 мл 18%-ного раствора натрия сульфита и добавляют по 0,1 мл сыворотки крови, смешивают и через 20 мин колориметрируют на ФЭК-56М при синем светофильтре (540 нм) или на КФК-2, КФК-3 при длине волны 400 ± 5 нм в кювете с толщиной слоя 5 мм против 18%-ного раствора натрия сульфита.

Если оптическая плотность (экстинкция) подготовленного образца сыворотки крови выше 1,3—1,5, сыворотку разводят изотоническим раствором натрия хлорида 1 : 1 и повторяют измерение. Полученные результаты параллельных определений складывают и усредняют.

Расчет ведут по калибровочной кривой, построенной с использованием сыворотки крови с известным содержанием иммуно-

13. Содержание иммуноглобулинов (ГС) в сыворотке крови в зависимости от оптической плотности

глобулинов.

Примечание. Метод приемлем в основном для определения иммунных глобулинов у новорожденных животных.

Источник: 20.

Определение иммунных белков в сыворотке крови по реакции с цинка сульфатом (цинк-сульфатный тест — ЦСТ). Принцип. При внесении в раствор, содержащий иммунные белки, цинка сульфата изменяется белковая молекула и раствор мутнеет. Степень помутнения раствора прямо пропорциональна содержанию иммуноглобулинов и может быть измерена фотометрическими приборами.

Реактивы: 20,8 мг/100 мл раствор сульфата цинка (х. ч.). Готовят в день исследований на прокипяченной дистиллированной воде (для удаления углекислого газа). Длительному хранению не подлежит;

барий сульфатный — стандарт мутности: 3 мл 1,15%-ного раствора бария хлорида (х. ч.) на дистиллированной воде вносят в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки 0,2%-ным раствором серной кислоты. Полученный раствор соответствует 20 ед. ЦСТ по степени мутности. Для приготовления стандарта 40 ед. мутности в мерную колбу на 100 мл вносят 6 мл 1,15%-ного раствора бария хлорида, а для стандарта с 10 ед. мутности — 1,5 мл. Далее растворяют, как в предыдущем случае. По полученным трем стандартным растворам мутности (10,20, 40 ед.) строят калибровочную кривую для данного прибора (ФЭК).

Рис. 1. Форменные элементы крови (норма):

А — крупного рогатого скота; ? — овцы; / — базофилы; 2 — эозннофилы; 3 — юные нейтрофилы; 4 — палочкоялерные нейтрофилы; 5 — сегментоялерные нейтюфпы; б, "и 8 — малый, средний и большой лимфоциты; 9и 10— моноциты; //и 12 — клетки Тюрка; 13 — эритроциты и ретикулоциты; 14 — тромбоциты (по Н. П. Рухлядеву)

Плазмоцит

Рис.

Схема кроветворения по И. Л. Черткову и А. И. Воробьеву

Рис. III. Форменные элементы крови:

/4 — лошади; Б — евниьи: I — базофилы; 2 — эозинофилы;.) - - палочкояаерные нейтрофьаы; 4 — сегчеитояаериые иейтрофилы; 5 и 6 — малый и большой лимфоциты; 7 и 8 — моноциты; 9— клетки Тюрка; 10 — эритроциты; II — тромбоциты (по Н. П. Рухлядеву)

  Рис. IV элементы крови:

  Рис. V. Форменные элементы крови:

  Рис. VI. Поражение крови:

  Рис. VI. Поражение крови:

Рис. VII. Картина крови при В12- дефицитной анемии: отмечается гиперхромия, анизоцитоз эритроцитов с преобладанием макроцитов; мегалоциты, мегалобласты, эритроциты с остатками ядра в виде телец Аолли. колец Кебота; эритроциты с базофильнон зернистостью: гнперсегмеитироваииый нейтрофил (по А. Г. Абрамову)

Оборудование: фотоэлектроколориметр; пробирки химические на 5, 10 мл; пипетки на 1,5 и 10 мл; мерные колбы на 100 мл.

Ход определения. В опытную пробирку вносят 6 мл

8. мг%-ного раствора цинка сульфата, в контрольную — 6 мл дистиллированной воды. В обе пробирки добавляют по 0,1 мл сыворотки крови и выдерживают при комнатной температуре 1 ч, в течение которого содержимое пробирок перемешивают 3 раза. Фо- тометрирование проводят в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 670 нм (красный светофильтр) против контроля. По полученному значению экстинкции на калибровочной кривой находят значение ед. ЦСТ. При пересчете содержания иммунных белков в сыворотке крови можно пользоваться таблицей 14.

   14. Пересчет содержания иммунных белков в сыворотке крови (Н. И. Блинов), мг/ мл

Примечание. Сыворотка крови не должна иметь следов гемолиза. Пробирки с сывороткой закрывают резиновыми пробками. Метод преимущественно используют для определения иммунных белков в крови новорожденных животных.

Источники: 9, 29.