Определение общего рибофлавина в крови.  

Реактивы: 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты;

4. моль/л раствор калия фосфата двузамещенного (К2НРО4);

10%-ный раствор натрия гидросульфита (МаН8204) в 5%-ном растворе натрия гидрокарбоната (ИаНСОз).

калибровочный основной раствор рибофлавина, содержащий 100 мкг в 1 мл. Рабочий калибровочный раствор рибофлавина с содержанием 20 мкг в 1 мл: 10 мл основного раствора разводят до 50 мл дистиллированной водой.

Оборудование: пробирки центрифужные; пипетки на

1. мл; пробирки с притертыми пробками; термостат; флуори- метр.

Ход определения. Первый вариант. В центрифужную пробирку вносят 2 мл оксалатной крови и 8 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты (или 2 мл крови, 3 мл дистиллированной воды и 5 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты). Тщательно перемешивают стеклянной палочкой, оставляют в темноте на 60 мин. Затем содержимое пробирки снова перемешивают и центрифугируют при 3000 мин 1 в течение 30 мин. Прозрачную надосадочную жидкость помещают в термостат при температуре 37—38 °С на 20 ч или при комнатной температуре на 2 сут для гидролиза ФАД. После этого пробирку охлаждают и к 8 мл гидролизата приливают 2 мл 4 моль/л раствора К2НРО4, перемешивают и оставляют стоять 1—2 ч в темноте для нейтрализации. Затем измеряют флуоресценцию при помощи флуориметра с первичным светофильтром, имеющим максимум поглощения около 420 нм, и со вторичным — с максимумом поглощения около 560 нм.

Для измерения нейтрализованный раствор вносят в кювету флуориметра и делают первый замер интенсивности флуоресценции (Р]).

Расчет содержания рибофлавина (х) ведут по формуле

Количество мкг рибофлавина в 1 мл стандарта - (Р, - Р\) х =               ;                                          — • 100.

Количество мл крови (Р2- Р1)

Второй вариант. Вытяжку и калибровочный рабочий раствор рибофлавина вносят в две одинаковые пробирки или кюветы и измеряют интенсивность их флуоресценции посредством флуори- метра по шкале гальванометра. В обе пробирки прибавляют на кончике шпателя ИаНСОз и №^204 (примерно по 0,1 г) для гашения флуоресценции рибофлавина и снова измеряют флуоресценцию.

Расчет содержания рибофлавина ведут по формуле

,А-Б) -20.УУ2 ВлУ[

где х — содержание рибофлавина, мкг%; А — показания флуориметра для испытуемого раствора (первый отсчет); Б — показания флуориметра для испытуемого раствора после погашения (второй отсчет); В — показания флуориметра для калибровочного раствора, содержащего 20 мкг в 1 мл; 20 — содержание рибофлавина в 1 мл калибровочного рабочего раствора, мкг; п — количество крови, мл; V — общее разведение, мл; К[ — фильтрат, взятый на окисление, мл; — фильтрат после окисления, мл.

Источники: 8, 75.

Клиническое значение. Источник рибофлавина — корма, кроме того, он синтезируется бактериями преджелудков и кишечника. Бактериальный синтез рибофлавина наиболее выражен у жвачных животных, поэтому при рациональном их кормлении они не испытывают недостатка этого витамина. В слизистой оболочке кишечника, в печени и других тканях рибофлавин при участии АТФ фосфорилируется и превращается в активные соединения — коферменты флавин-мононуклеоитид (ФМН) и фла- вин-адениннуклеотид (ФАД).

* В величины Р2 и Ръ вводят поправки на разведение, т. е. умножают на соответствующее разведение.

веществ. ФАД является коферментом дегидрогеназ (3-окисления жирных кислот, сукцинадцегидрогеназы, ксантинкиназы и других ферментов.

У здоровых животных в крови 8—15 мкг%, в печени 39,6— 46,6 мкг/г общего рибофлавина. Снижение содержания рибофлавина в крови и печени отмечается при недостаточном его поступлении с кормом, даче животным внутрь антибиотиков, аминазина, обладающих антивитаминным действием и подавляющих бактериальный синтез. При гиповитаминозе В2 уровень рибофлавина в крови телят составляет 6 мкг% и ниже.