Определение аммиака микродиффузионным методом.  

Реактивы: 0,02 н.

насыщенный раствор К2СОз;

0,01 н. (0,01 моль/л) раствор натрия гидроксида;

индикатор Таширо. Готовят два раствора: 1) 50 мг метиленового синего растворяют в 50 мл спирта; 2) 100 мг метиленового красного (метилрота) растворяют в 50 мл спирта. Затем оба раствора соединяют в равных объемах.

Оборудование: чашки Конвея; пипетки; бюретки на 2 мл.

Ход определения. Предварительно подготавливают чашку Конвея, наружный верхний край ее смазывают вазелином. Во внутреннюю камеру чашки Конвея заливают точно отмеренное количество 0,02 н. раствора серной кислоты. Исходя из предполагаемого уровня аммиака в пробе объем раствора может быть 2 или

3. мл. Туда же добавляют 3—4 капли индикатора Таширо. В наружную камеру чашки Конвея наливают 1 мл рубцовой жидкости и чашку закрывают крышкой. Затем, чуть приоткрыв крышку, в наружную камеру осторожно с противоположной стороны от налитой рубцовой жидкости вливают 2 мл насыщенного раствора К2СОз. Крышку быстро закрывают, проверяют герметичность камеры и осторожно смешивают исследуемую жидкость со щелочью.

Параллельно с опытными ставят контрольную («слепую») пробу, при этом в наружную камеру чашки вместо рубцовой жидкости наливают 1 мл дистиллированной воды. Остальные манипуляции такие же, как и с опытной пробой.

Затем чашки с опытными пробами и контрольную ставят на время, необходимое для полного вытеснения из анализируемого раствора аммиака и последующего поглощения его раствором серной кислоты. Обычно диффузия при комнатной температуре продолжается не менее 12 ч.

Расчет ведут по формуле

х={А-Б)- 0,17 -100,

где х — количество аммиака в 100 мл жидкости, мг; А — количество 0,01 н. раствора NaOH, пошедшего на титрование контрольной пробы, мл; Б — количество 0,01 н. раствора NaOH, пошедшего на титрование опытной пробы, мл; 0,17 — количество аммиака, эквивалентное 1 мл 0,01 н. раствора NaOH или 1 мл 0,01 н. раствора H2SO4, мл; 100 — коэффициент для перевода в мг/100 мл.

Следует отметить, что данный метод анализа позволяет улавливать не только свободный газообразный аммиак, но и аммиак рубцового содержимого, находящийся в связанном состоянии в виде аммония. Поэтому лучше рассчитывать содержание в рубцовой жидкости азота аммиака или аммонийного азота по формуле

х= (А- Б)- 0,14 -100,

где 0,14 — количество аммонийного азота, эквивалентное 1 мл 0,01 н. раствора NaOH или 1 мл 0,01 н. раствора H2SO4, мл.

Пример: на титрование контрольной пробы пошло 4 мл 0,01 н. раствора NaOH; на титрование опытной пробы — 2,24 мл 0,01 н. раствора NaOH; х = (4,00 - 2,24) • 0,14 • 100 = 24,64 мг/100 мл. Следовательно, в 100 мл рубцовой жидкости содержится 24,64 мг азота аммиака или аммонийного азота.

Клиническое значение. Аммиак — конечный продукт превращения белковых и небелковых веществ корма. Количество его, образующееся в рубце, зависит в первую очередь от количества белка, соотношения легко- и тяжелорастворимого протеина в кормах рациона, азотсодержащих небелковых соединений, а также о^, интенсивности его использования при синтезе микробного белка и всасывания в кровь. При обычных условиях кормления концентрация аммиака может составлять от 5 до 40 мг/100 мл (2,8—22 ммоль/л), но оптимальное количество 6,5—25 мг/100 мл.

Скорость образования аммиака и его концентрация в содержимом рубца определяются обеспеченностью рационов энергией и использованием аммиака рубцовой микрофлорой для синтеза белка.

Увеличение образования аммиака в рубце наблюдается при нарушении соотношения в кормах рациона между легко- и труднорастворимым протеином (оптимальным является 50—60 % легкорастворимого протеина в начале лактации и 65—70 % в средней и последней трети лактации); при скармливании зеленой массы люцерны, клевера, озимой ржи; при повышенном уровне нитратов в кормах; использовании углеаммонийных солей, аммиачной воды; скармливании некачественного силоса и сенажа, в которых содержание аммонийного азота может составлять 35—50 % общего азота. Кроме того, в этих случаях pH содержимого рубца смещается в щелочную сторону, что увеличивает скорость всасывания аммиака в кровь.

Обезвреживание аммиака нарушается при патологии печени (гепатит, цирроз, гепатодистрофия) вследствие уменьшения синтеза мочевины. Количество его в крови увеличивается (гипераммо- пиемия): в артериальной до 20—129 мкмоль/л, в венозной до 12—85 мкмоль/л (у здоровых коров 7,0—30,0 и 5,5—25 соответственно). Аммиак легко проникает через гематоэнцефалический барьер и его количество в ликворе может составить 40—64 мкмоль/л против 8,5 мкмоль/л у здоровых коров (В. В. Влизло, 1998). Соли аммония резко угнетают обмен ацетилхолина, и у животных развивается печеночная энцефалопатия и печеночная кома.

Накапливающийся в тканях аммиак блокирует цикл Кребса, что неминуемо ведет к нарушению окислительно-восстановительных процессов в организме, т. е. к состоянию гипоксии. Угнетение тканевого дыхания имеет следствием нарушение синтеза макроэр- гических соединений (АТФ, КФ).

Принцип. Метод базируется на реакции Грисса, по которой при взаимодействии реактива Грисса с ионами N02 образуется окрашенный раствор; интенсивность окраски зависит от концентрации нитритов.

Реактивы: 0,3 н. раствор Ва(ОН)2;

5%-ный раствор цинка сульфата;

фенолфталеин (индикатор);

5%-ный раствор аммиака;

0,1 н. раствор кислоты хлористоводородной (НС1);

96%-ный этиловый спирт;

сульфаниловая кислота;

а-нафтиламин;

12%-ный раствор кислоты уксусной;

реактив Грисса. Состоит из равных объемов двух растворов; а) 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 150 мл 12%-ного раствора уксусной кислоты; б) смешивают 180 мл 12%-ного раствора уксусной кислоты с фильтратом водного раствора а-нафтиламина, полученного при кипячении 0,2 г последнего в 20 мл дистиллированной воды. Хранят раствор в темном месте, а перед употреблением готовят необходимое количество раствора Грисса.

Оборудование: фотоэлектроколориметр или спектрофотометр; мерные колбочки на 100 мл.

Ход определения. Предварительно важно приготовить осадители. Оба раствора [0,3 н. Ва(ОН)2 и 5%-ный раствор гпБО^ должны точно нейтрализовать друг друга по фенолфталеину (объем на объем). Затем осаждают белки рубцовой жидкости. Для этого в пробирки наливают по 2 мл рубцовой жидкости, добавляют такой же объем бария гидроксида и цинка сульфата. Смесь тщательно смешивают и центрифугируют 15 мин при 3000—5000 мин \

20 мл полученного центрифугата переносят в мерную колбу на 100 мл, куда последовательно добавляют 5 мл 5%-ного раствора аммиака, 10 мл 0,1 н.

Калибровочный график строят по стандартному раствору натрия нитрита (№N02) с концентрацией нитрита от 0,1 до 1 мкг в 1 мл.

Расчет количества нитритов в 100 мл рубцовой жидкости ведут по формуле где х — количество нитритов в 100 мл рубцовой жидкости, мкг; Е — показатель количества нитритов в 1 мл, соответствующих полученной экстинкции; 1500 — произведение 15 • 100, где 15 — число, на которое умножают количество рубцовой жидкости, содержащейся в 20 мл безбелкового фильтрата, чтобы привести к 100 мл рубцовой жидкости; 100 — число, на которое необходимо умножить количество нитритов, найденное по калибровочному графику (?), чтобы определить, сколько нитритов содержится в 20 мл безбелкового фильтрата.

Если показатель экстинкции выше диапазона калибровочной кривой, полученный безбелковый фильтрат разводят определенным количеством дистиллированной воды и при расчетах учитываю степень разведения (Р) фильтрата. Количество нитритов в этом случае определяют по формуле

*=?•1500-Р.