Определение алкалоццов методом ТСХ (по В. М. Серову, В. А. Волковой, 1979) 

Метод позволяет определять алкалоиды в количестве 2—50 мг/кг.

Реактивы: вышеперечисленные алкалоиды и их растворы в хлороформе концентрацией 5 мг/мл;

алюминия оксид для хроматографии II степени активности;

10%-ный раствор 25% (ч. д. а.) аммиака водного;

висмута нитрат основной (ч. д. а.);

динопиловый эфир фталевой кислоты (динопилфталат) для хроматографии (ч. д. а.);

калия йодид (х. ч.);

кислота винная (ч. д. а.);

5 и 10%-ный растворы кислоты серной (ос. ч.);

25%-ный раствор кислоты уксусной (х. ч.);

кислота щавелевая (ч. д. а.);

подвижный растворитель для ТСХ: хлороформ-ацетон-дино- пилфталат (5:4: 1);

реактив I. Растворяют 16,5 г висмута нитрата в 500 мл 25%-ной уксусной кислоты, отдельно растворяют 80 г калия йодида в 200 мл дистиллированной воды, оба раствора смешивают (1:1) и выдерживают в склянке из темного стекла 1 мес. Для проявления алкалоидов смешивают 20 мл готового раствора с 20 мл ледяной уксусной кислоты и 100 мл воды, предел обнаружения на бумаге — 3—5 мкг алкалоида;

реактив II. В 800 мл дистиллированной воды растворяют 200 г винной кислоты, затем 17 г висмута нитрата. Отдельно растворяют 160 г калия йодида в 400 мл воды. Оба раствора смешивают и хранят в склянке из темного стекла. Для проявления алкалоидов берут 10 мл основного раствора, вносят 50 мл воды и растворяют 10 г винной кислоты. Чувствительность реакции на бумаге — 1—3 мкг алкалоида.

Оборудование: бумага хроматографическая марки «М»; камера для люминесцентного анализа или УФ-осветитель; мельница электрическая МРГ-1; сито 100 меш.; центрифуга со стаканами вместимостью 100 мл и более и другое оборудование, необходимое для проведения анализа с помощью ТСХ.

Ход определения.

При экстракции в виде солей 100 г измельченной пробы кормов заливают водой в соотношении для сочных кормов 1 : 4, для сухих — 1:10. В склянку с материалом при постоянном помешивании добавляют 10%-ный раствор серной кислоты до pH 3. Затем склянку тщательно взбалтывают и ставят в водяную баню при температуре 40 °С на 2 ч при периодическом помешивании. Дальнейшее исследование сочных кормов проводят сразу же после окончания нагревания, сухих объектов — через 24 ч после настаивания.

Водную вытяжку из растений фильтруют через бумажный фильтр в делительную воронку, промывают хлороформом порциями по 30 мл 2 раза путем легкого взбалтывания в течение 5 мин. Хлороформ отделяют и отбрасывают, а к очищенной водной фазе (желательно на холоде) добавляют раствор аммиака до pH 9. Подщелоченную водную вытяжку переносят во вторую делительную воронку и алкалоиды экстрагируют хлороформом 3 раза по 50, 30 и 20 мл путем легкого взбалтывания в течение 5—7 мин. Хлороформные экстракты объединяют, фильтруют через бумажный фильтр, предварительно смоченный обезвоженным хлороформом, в выпарительную чашку и упаривают досуха в токе воздуха.

Экстракцию в виде оснований применяют только для сухих кормов и высушенных ядовитых растений. Для этого 100 г измельченной пробы смачивают 10%-ным раствором аммиака до слабого увлажнения, переносят в склянку, плотно закрывают и оставляют на 30 мин. По истечении этого срока массу заливают хлороформом в соотношении 1 : 8 и оставляют при комнатной температуре на

24. ч. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в делительную воронку и трижды реэкстрагируют 5%-ным водным раствором серной кислоты порциями по 50, 30 и 20 мл. Экстракты объединяют, фильтруют через ватный фильтр, вносят 10%-ный раствор аммиака до pH 9 и вновь извлекают хлороформом, промывая порциями по 30 мл. Хлороформные экстракты объединяют, фильтруют через бумажный фильтр в чашку для упаривания и упаривают досуха в токе воздуха.

Для идентификации алкалоидов сухой остаток одной пробы растворяют в 1 мл хлороформа.

Затем начинают хроматографирование. На старт хроматографической пластинки микропипеткой или микрошприцем наносят 20 мкл хлороформных экстрактов. Для контроля рядом наносят стандартные растворы алкалоидов или же экстракты из отобранных ядовитых растений. Пластинку помещают в камеру для хроматографирования, используя в качестве подвижной фазы смесь хлороформа, ацетона и линопилового эфира фталевой кислоты. Затем пластинку подсушивают и опрыскивают проявляющими реактивами I и II. Алкалоиды проявляются в виде пятен красного или малинового цвета на желтом фоне. Идентификацию алкалоидов, выделенных из кормов, проводят, сравнивая величины Ш- пробы и стандартов. Величины Ш- некоторых алкалоидов и окраска пятен приведены в таблице 59.

59. Величина М1 и цвет флуоресценции в зависимости от алкалоида

Клиническое значение.