МЕТОДЫ ПОДСЧЕТА МИКРООРГАНИЗМОВ В СОДЕРЖИМОМ РУБЦА  

Росту и развитию большого количества разнообразной по составу микрофлоры и микрофауны способствуют определенные благоприятные условия среды в рубце, в том числе pH содержимого, постоянный ионный состав, непрерывное снабжение микроорганизмов питательной средой (кормом), анаэробные условия.

Бактерии и простейшие очень тесно реагируют на изменения кормления и содержания животных. Например, количество инфузорий увеличивается при добавке к рациону достаточного количества сена, углеводистых кормов. Если же в рационе преобладает силос, количество простейших уменьшается, изменяется их видовой состав. Летом при кормлении зелеными кормами их, как правило, становится больше по сравнению с зимним рационом. Почти полностью они исчезают при голодании, патологическом состоянии преджелудков, атонии, тимпании рубца, травматическом ретику- лоперитоните.

Определение количества инфузорий. В рубце у жвачных находится примерно 100 видов инфузорий. Преимущественно они представлены классом СШа1а, в который входят две большие группы: подкласс НокЛпсЬа и подкласс Зрко^юЬа. Инфузории первой группы равнореснитчатые (вся их поверхность равномерно покры-

та ресничками). Подкласс БрйоМсЬа (малореснитчатые) в рубце составляет 60—80 % общего количества инфузорий.

Наличие в рубце большого количества инфузорий свидетельствует о нормальном и эффективном течении ферментативных процессов.

Видовой состав простейших определяют только в свежем содержимом рубца. Для этого каплю его наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и рассматривают по микроскопом вначале при малом (окуляр х7, объектив * 10), затем при большом (окуляр *7, объектив х40) увеличении в слегка затемненном поле зрения. Поскольку инфузории, особенно большие, при комнатной температуре быстро теряют подвижность, то можно пользоваться столиком с подогревом (температура 38—39 °С). Для более детального определения строения инфузорий препарат лучше покрасить раствором Люголя или приготовить мазок и рассматривать его при большом увеличении или под иммерсией.

Реактив: 0,85%-ный раствор КаС1, слегка окрашенный метиленовым синим.

Оборудование: микроскоп; счетная камера с сеткой Горяева; лейкоцитарный меланжер.

Ход определения. В пробирку отбирают 5 мл профильтрованного содержимого рубца (жидкую часть) и добавляют 0,1 мл 4%-ного раствора формалина для фиксации инфузорий. Это позволяет подсчитывать количество инфузорий в течение 20—24 ч после взятия содержимого рубца. Содержимое пробирки тщательно перемешивают, набирают жидкость в лейкоцитарный смеситель (меланжер) до метки 1, а до метки 11 — изотонический раствор натрия хлорида, предварительно окрашенный раствором метиленового синего. Встряхивают 1—2 мин и получают разведение пробы в 10 раз.

В камеру с сеткой Горяева под покровное стекло вносят 1 каплю жидкости (первую каплю выдувают на вату). Инфузории подсчитывают в 100 больших квадратах. Общее количество инфузорий в 1 мм3 (1 мкл) определяют по формуле

х = АС/пБк, т. е. х = А • 25,

где х — количество инфузорий в 1 мм3 (1 мкл); А — количество подсчитанных инфузорий; С — разведение пробы; п — количество квадратов, в которых подсчитывали инфузории (100); 5 — площадь одного квадрата (1/25); А — высота камеры (0,1).

Количество инфузорий в 1 мл содержимого рубца определяют по формуле х = А • 1000, ибо 1 мл = 1000 мкл.

В 1 мл жидкости рубца находится от 500 тыс. до 1,2 млн инфузорий.

Подсчет бактерий. Бактерии играют важную роль в процессах пищеварения жвачных животных. Они подвергают ферментному расщеплению целлюлозу (основной компонент грубых кормов), крахмал, моносахариды, кислоты (молочную, янтарную, муравьиную), липиды, принимают участие в превращении азотистых соединений. Наряду с основными видами существует ряд бактерий, которые не имеют функционального значения в рубцовом пищеварении, а попадают в рубец с кормом и водой.

Чисто рубцовые бактерии должны отвечать определенным требованиям: 1) выделенные из рубца микроорганизмы должны быть анаэробными; 2) бактерии должны присутствовать в рубце в количестве не менее чем 1 млн в 1 мл содержимого; 3) по 10 штаммов данного вида бактерий должно быть выделено не менее чем от двух животных; 4) культуры данного вида бактерий должны присутствовать в рубце животных различных географических зон; 5) конечные продукты обмена веществ полученных культур микроорганизмов должны быть типичными рубцовыми метаболитами.

В 1 мл рубцового содержимого присутствует 109— Ю10 бактерий.

Реактив: 0,85%-ный раствор NaCl.

Оборудование: микроскоп; микропипетки.

Ход определения. Содержимое рубца разводят стерильным изотоническим раствором натрия хлорида в соотношении 1:1000. Микропипеткой отбирают 0,01 мл этого разведения и про- фламбированной петлей размазывают его на предметном стекле на площади 1 см2. Как правило, делают 3—4 мазка. Мазок высушивают над пламенем спиртовки и красят по Граму. Готовый мазок исследуют под иммерсией. Подсчитывают бактерии в определенном количестве типичных полей зрения. В связи с тем что мазок не всегда получается равномерным, поля зрения для подсчета необходимо брать по всему мазку, а лучше по диагонали. В каждом мазке подсчитывают не менее 10 полей зрения и выводят среднее значение для одного поля.

Чтобы определить общее количество бактерий всего мазка, уточняют площадь поля зрения микроскопа.

Таким образом, подсчитав необходимое количество полей зрения (по 10 в трех мазках), суммируют общее количество бактерий и вычисляют среднее количество бактерий в одном поле зрения. Полученное число умножают на коэффициент и степень разведения. Коэффициент остается постоянным до тех пор, пока объектив, положение тубуса и окуляр микроскопа не меняются.

Пример. Определяем коэффициент. Диаметр поля зрения микроскопа 0,132 мм, соответственно его радиус — 0,066 мм, а г составляет 0,004356:

10 000 = 10 000 3,1417 0,004356 0,0137'

Подсчитав 30 полей зрения (по 10 в трех мазках), определили, что в поле зрения в среднем находится 15 микробных клеток.

Соответственно ^              • 1000 = 10,9 млрд = 1,09 • Ю10 мик

робных клеток в 1 мл рубцовой жидкости.