КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КЛАССОВ ЛИПИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ  

    Определение содержания фосфолипидов (по Бартлетту—Ушеру).  Принцип.

Реактивы: экстракционная смесь Фолча (хлороформ-метанол, 2 : 1);

72 %-ная хлорная кислота (НСЮ4) или смесь равных объемов 60%-ной хлорной и 95—97%-ной серной кислот (плотность 1,84);

5%-ный раствор аммония молибдата [ЫН4)б • М07О24 • Н2О];

сульфит-сульфоновый реактив. 13 г пиросульфита натрия (№28205), 0,5 г сульфита натрия (Ка280з) и 0,25 г эйконогена (1-амино-2-нафтол-4-сульфоновая кислота) растворяют в 100 мл дистиллированной воды (перегнанной в стеклянном дистилляторе) при постоянном встряхивании в течение 1 ч. Фильтруют через бумажный фильтр (лучше через синтетический № 4) и хранят в темной склянке. Реактив готовят еженедельно.

Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; песчаная баня; водяная баня; колбочки плоскодонные на 50 и 100 мл; воронки; пробирки с притертыми пробками и делениями на 10 мл; пипетки.

Ход определения. Для анализа берут 0,5 мл сыворотки крови, 0,5 г гомогената тканей или 0,2—0,4 г желтка и экстрагируют по методу Фолча. В две параллельные пробирки вносят экстракт липидов в объеме, соответствующем 0,1 мл сыворотки крови, 0,02 г тканей или 0,01 г яичного желтка, добавляют по 0,6 мл хлорной кислоты и ставят на песчаную баню для сжигания при 180 °С.

После просветления содержимого (через 1—1,5 ч) пробирки охлаждают и, тщательно перемешивая, последовательно добавляют следующие реактивы: по 4 мл дистиллированной воды, по 0,2 мл сульфит-сульфонового реактива и по 0,2 мл раствора аммония мо- либдата.

Расчет ведут по калибровочному графику, для построения которого используют двузамещенный фосфорнокислый калий (К2НРО4), высушенный до постоянной массы. 2,194 г реактива растворяют в 500 мл бидистиллированной воды. 1 мл раствора содержит 1 мг фосфора. Из основного раствора готовят рабочий раствор путем 50-кратного разведения водой (в 1 мл содержится 20 мкг фосфора). Если определение оптической плотности проводят на ФЭКе, то калибровочный график строят в пределах от 0,2 до 20 мкг, если же на спектрофотометре, то от 5 до 60 мкг фосфора (табл. 21).

21. Приготовление растаоров для иостроеиия калибровочного графика

Из каждого разведения берут по 2 мл калибровочного раствора, вносят в 2—3 параллельных пробирки и далее проделывают все операции, как описано выше.

Содержание общих фосфолипидов обычно выражают через количество содержащихся в них фосфатов — в ммоль/1 л, содержание отдельных фракций — также через содержание фосфатов или в процентах по отношению к сумме фосфора всех фосфолипидов.

Пересчет фосфора в фосфолипидах путем умножения на 25 нельзя признать правильным, так как это соответствует только для фос- фотидилхолинов (лецитинов), в молекуле которых содержится 4 % фосфора. В других подклассах фосфолипидов доля фосфора иная.

Клиническое значение. Фосфолипиды поступают в кровь главным образом из печени, поэтому их уровень тесно связан с функциональным состоянием данного органа. Концентрация общих фосфолипидов в норме составляет у крупного рогатого скота 170—250 мг/100 мл, у свиней — 90—200 мг/100 мл. Повышение концентрации фосфолипидов в сыворотке крови отмечается при стеотозе (жировой дегенерации) печени, тяжелой форме сахарного диабета, нефрозе и нефрите, постгеморрагической анемии. Снижение уровня фосфолипидов — частый признак острого и хронического гепатита различной этиологии; оно отмечается также при неполноценном кормлении, особенно белково-витаминной недостаточности, при дисбалансе аминокислот в рационе, алиментарной дистрофии, анемиях.

Определение содержания триацилглицеринов (по Сардесаю и Маннингу). Принцип. Метод представляет собой модификацию метода Ван-Ханделя и Зильверсмита (1957) для прямого определения триацилглицеринов. Глицерол, освобожденный омылением, окисляется до формальдегида, концентрация последнего определяется колориметрически с применением реакции Hantzsch. Данный метод позволяет выявить триацилглицерины во всех биологических субстратах — сыворотке крови, печени, мышцах, жировой ткани и др.

Кровь с гепарином или с ЭДТА может храниться в вакуумной пробирке в течение 8 ч. Пробы не замораживают.

Реактивы: экстрагирующая смесь (хлороформ-метанол 2 : 1 или спирт-эфир 3:1);

кремниевая кислота (силикагель), активированная при 105 °С в течение 10—12 ч;

спиртовой раствор калия гидроксида (КОН).

0,1 моль/л раствор серной кислоты;

0,05 моль/л раствор метперйодата (NalO^;

0,5 моль/л раствор натрия арсенита (NaAs02); ацетил-ацетоновый реактив, pH 6,0 при 25 °С. 150 г аммония ацетата, 3 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл ацетил-ацетонового реактива растворяют в 1 л дистиллированной воды. Реактив стоек в течение 2 нед при хранении в холодильнике;

1%-ный стандартный раствор триацилглицеринов. 1 г триолеи- на или оливкового масла растворяют в 100 мл хлороформа. Хранят в холодильнике, стоек 2 мес.

Оборудование: спектрофотометр или ФЭК; водяная баня; пробирки обычные и центрифужные с делением; колбочки или пробирки на 10 мл; делительные воронки на 25 и 50 мл.

Ход определения. 0,1мл сыворотки (плазмы) вносят в колбочку, заливают экстрагирующей смесью и тщательно перемешивают. Через 2—3 мин содержимое пропускают через обезжиренный бумажный фильтр в мерную колбочку, доводят объем экстрагирующей смесью до 10 мл. В делительную воронку на 25 мл вносят 8 мл дистиллированной воды и 8 мл фильтрата (что соответствует 0,08 мл сыворотки). Содержимое хорошо перемешивают, отстаивают и нижний слой пропускают через стеклянную колонку размером 0,8 х 16 см (для задержки фосфолипидов), приготовленную следующим путем: в центрифужную пробирку со спиленным дном помещают кусочек стеклянной ваты и 0,5 г активированной кремовой кислоты. Перед использованием колонку промывают

5. мл хлороформа. Фильтрат пробы собирают в мерную колбочку на 10 мл или пробирку с делениями. Колонку промывают хлороформом, который также собирают в колбочку. Объем доводят хлороформом до метки. Затем в 3 пробирки вносят по 3 мл фильтрата (что соответствует 0,024 мл сыворотки или плазмы) и после выпаривания растворителя в водяной бане в первые две пробирки добавляют по 0,5 мл спиртового раствора КОН (омыляемые пробы), а в третью — 0,5 мл спирта (неомыляемая проба).
   Пробирки инкубируют в водяной бане 15 мин при 60 °С. В конце инкубации в каждую из них добавляют по 0,5 мл 0,2 н. раствора серной кислоты, а затем по 0,1 мл 0,05 моль/л раствора метперйодата натрия (для окисления глицерина, освобожденного омылением).

Через 10 мин (точно!) окисление приостанавливают добавлением по 0,1 мл 0,5 моль/л раствора натрия арсенита. Через 5—7 мин, когда испарится осводившийся йод, пробирки извлекают из бани и в них добавляют по 0,8 мл воды и по 2 мл ацетил-ацетонового реактива. Содержимое тщательно перемешивают перевертыванием пробирки и инкубируют в водяной бане при 58 °С в течение 10 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и колориметрируют при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя 0,5 см против контроля.

Степень поглощения омыляемой пробы минус степень поглощения неомыляемой пробы соответствует количеству триацилглицеринов, содержащихся в 0,24 мл исходного объема сыворотки (плазмы) крови. В используемом объеме сыворотки (плазмы) крови показания неомыляемых проб обычно очень малы и не имеют существенного значения.

Расчет ведут по формуле или калибровочному графику, который строят в пределах от 10 до 250 мкг/мл триацилглицеринов.

х (,Еоп/Е„) Сст,

где х — количество триацилглицеринов, мкг%; Еоп — экстинкция опытной пробы; Е„ — экстинкция стандартной пробы; Сст — концентрация триолеина в стандартном растворе, мг%.

Из основного раствора готовят серию рабочих калибровочных растворов (табл. 22).

22. Приготовление рабочих калибровочных растворов

В 5 опытных пробирок вносят по 1 мл каждого рабочего раствора и в шестую пробирку — 1 мл хлороформа для контроля на реактивы.

Примечания. 1. Для анализа лучше использовать плазму крови, полученную на холоде, так как при получении сыворотки происходит частичный гидролиз триацилглицеринов. 2. В качестве антикоагулянта применяют ЭДТА натриевой или калиевой соли (1 мг на 1 мл крови). Гепарин применять не следует, так как он активирует липопротеидную липазу, гидролизирующую триацилглицерины.

Клиническое значение. Концентрация триацилглицеринов (нейтральных жиров) в сыворотке крови животных повышается при скармливании кормов, обогащенных жирами или богатых легкодоступными углеводами (картофель, зерно кукурузы, пшеницы и др.), активизирующих липогенез в печени (у моногас- тричных). Недостаток в рационах протеина и липотропных веществ (холина, метионина, треонина, селена, витамина Е, никотиновой кислоты и др.) также сопровождается нарастанием уровня нейтральных липидов в сыворотке крови животных. Увеличение концентрации триацилглицеринов отмечается при острых гепатитах, жировой дистрофии печени, нефрозах, диабете. Снижение их концентрации наблюдается при низком уровне кормления животных, усиленной молокоотдаче.

Нормативы содержания триацилглицеринов в сыворотке крови животных приведены в приложении 5.