КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРАТОВ И НИТРИТОВ (ПО Е. С. КОВАЛЕВОЙ, 1985)

Метод одобрен отделением ветеринарии ВАСХНИЛ, 1985. Принцип. Метод основан на измерении интенсивности окрашивания комплекса, образующегося при взаимодействии нитрита-иона с амидом сульфаниловой кислоты и 1Ч-(1-нафтил)-этилен- диаминдигидрохлоридом.

Реактивы: натрий азотнокислый; калия нитрат;

цинк металлический гранулированный; кадмия сульфат; кислота хлористоводородная; трилон Б; аммиак водный;

калий железисто-синеродистый (желтая кровяная соль); цинка ацетат;

кислота уксусная, ледяная; натрия тетраборат (бура); активированный уголь марки БАУ-А, ОУА; алюминия сульфат;

амид сульфаниловой кислоты (стрептоцид белый);

N-(1 -нафтил)-этилендиаминдигидрохлорид;

0,1 н. раствор кислоты хлористоводородной; раствор кадмия сульфата. 37 г кадмия сульфата растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе на 1000 мл и доводят объем в колбе до метки;

буфер аммонийный, pH 9,6—9,7. 20 мл концентрированной кислоты хлористоводородной растворяют в 500 мл дистиллированной воды, перемешивают, добавляют 10 г трилона Б и 55 мл концентрированного аммиака, доводят объем в колбе до метки дистиллированной водой, перемешивают и проверяют pH;

насыщенный раствор буры. 50 г натрия тетрабората помещают в мерную колбу на 1000 мл, добавляют при тщательном перемешивании 500 мл воды и после растворения доводят объем в колбе до метки;

реактив Кареза I. 106 г калия железисто-синеродистого растворяют в колбе на 1000 мл и доводят объем до метки. Хранят не более 1 мес;

реактив Кареза II.

растворы для проведения цветной реакции: а) реактив I. 2 г амида сульфаниловой кислоты растворяют в 400—500 мл водного раствора кислоты хлористоводородной, приготовленной в соотношении 1:1, а затем доводят объем этой кислотой до 1000 мл; б) реактив II. 0,25 г 1Ч-(1-нафтил)-этилендиаминдигидрохлорида растворяют в 250 мл дистиллированной воды.

Приготовление губчатого кадмия. Гранулы цинка распределяют по дну кристаллизатора на расстоянии 3—4 мм друг от друга и заливают раствором кадмия сульфата. Через 3—4 ч осадок отделяют от цинка и помещают в стакан с водой, избегая его соприкосновения с воздухом. Затем его измельчают в гомогенизаторе в 0,1 н. растворе кислоты хлористоводородной, отмывая от пылевидных частиц, и хранят под слоем воды. Перед работой кадмий заливают на 1 сут 0,1 н. раствором кислоты хлористоводородной, промывают водой и заполняют им редукционную колонку, наполненную водой. Слой кадмия во время заполнения колонки периодически перемешивают стальной проволокой так, чтобы не оставалось пузырьков воздуха. Скорость потока жидкости через колонку не должна превышать 3 мл/мин.

Перед использованием редукционной колонки ее промывают 25 мл 0,1 н. раствором кислоты хлористоводородной, 50 мл аммонийного буферного раствора, разведенного водой в соотношении 1 : 9. Уровень жидкости в колонке должен быть выше уровня кадмия. Проверяют восстановительную способность колонки, используя стандартный раствор калия нитрата. Процент открытия должен быть не ниже 90, в противном случае кадмий переносят в химический стакан и заливают на 1—2 сут 0,1 н. раствором кислоты хлористоводородной.

Оборудование: ФЭК-56 или другой аналогичный прибор с зеленым светофильтром; редукционная кадмиевая колонка (описание дано в разделе «Реактивы и растворы»); колбы стеклянные различной вместимости; цилиндры мерные.

Ход определения.

Построение градуировочного графика состоит в следующем. В первую мерную колбу на 100 мл вносят 10 мл воды, в остальные — по 10 мл стандартного раствора каждой концентрации. Затем в каждую колбу вносят по 50 мл дистиллированной воды, добавляют по 10 мл реактива I для проведения цветной реакции и оставляют стоять в темноте в течение 5 мин, после чего добавляют по 2 мл реактива II и снова выдерживают в темноте в течение 5 мин, доводя водой до метки, и перемешивают. В результате реакции образуется раствор красного цвета, интенсивность которого измеряют на ФЭКе с зеленым светофильтром в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм.

Подготовка пробы. 2—10 г измельченного на гомогенизаторе растительного материала или тщательно размолотого на лабораторной мельнице сухого материала помещают в мерную колбу на 200 мл, заливают 100-—150 мл дистиллированной воды, добавляют 5 мл насыщенного раствора буры и выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре, периодически перемешивая, или ставят на ночь в холодильник при температуре 0—2 °С. Затем в колбу добавляют по 2 мл реактивов Кареза I и II, доводят объем до метки дистиллированной водой, перемешивают, выдерживают в течение 10—15 мин и фильтруют через складчатый фильтр, предварительно промытый дистиллированной водой. При плохой фильтрации пробу можно центрифугировать. Если фильтрат имеет окраску, его дополнительно пропускают через фильтр с молотым активированным углем, предварительно промытым дистиллированной водой. В фильтрате определяют содержание нитратов и нитритов.

При определении нитритов 10—50 мл очищенного фильтрата помещают в колбу на 100 мл, доводят объем дистиллированной водой до 60—65 мл и проводят цветную реакцию, как при построении градуировочного графика, доводят объем дистиллированной водой до метки, перемешивают и колориметрируют по отношению к контрольной пробе.

При определении нитратов 10—50 мл фильтрата пропускают через колонку с губчатым кадмием, заливая в воронку вместе с водой 5 мл аммонийного буферного раствора. Элюат собирают в мерную колбу на 100 мл. Колонку несколько раз промывают дистиллированной водой, которую сливают в эту же колбу до объема 60—65 мл. Доводят объем в колбе до метки, перемешивают, отбирают на цветную реакцию 10—15 мл и далее поступают, как при построении калибровочного графика. Если оптическая плотность окрашенного комплекса превышает максимальные значения оптической плотности градуировочного графика, то цветную реакцию повторяют с меньшими объемами исследуемой воды или фильтрата.

Расчет содержания нитритов (*1, мг/кг) ведут по формуле

„ _ С-200- 100 1 тУ '

где С — содержание нитритов в 1 мл окрашенного раствора, найденное по градуировочному графику, мкг; т — масса пробы, г; V — объем фильтрата для цветной реакции, мл.

Содержание нитратов (*2gt; мг/кг) вычисляют по формуле

„ С. 200 ,100. 100 . 65 тн = с_200. 100 . 1 lt;е тУуУг              *              У{т

где У\ — объем фильтрата, пропущенного через колонку с кадмием, мл; ^ — объем фильтрата, взятый для цветной реакции, мл; 1,465 — коэффициент пересчета калия нитрита на калия нитрат.

Второй формулой пользуются в случае, если берут весь объем элюата.

Клиническое значение. Обнаружение в кормах нитратов на уровне, превышающем 2000 мг/кг корма, и нитритов выше 100 мг/кг дает основание предполагать, что заболевание и гибель животных связаны с отравлениями нитратами или нитритами. Однако окончательный диагноз можно поставить только после анализа клинических признаков интоксикации (нарушение координации движений, сильно выраженный цианоз слизистых оболочек), исследования крови на метгемоглобин и результатов патологоанатомического вскрытия (кровь окрашена в темно-шоколадный цвет, плохо свертывается, паренхиматозные органы кровенаполнены).