МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ  

Большинство микотоксинов высокотоксичны для животных и относятся к I или II классу опасности с величиной ЛД50 для лабораторных животных менее 50 мг/кг. Отдельные микотоксины обладают дерматонекротическим, гепато-, эмбриотоксическим и тератогенным действием. Микотоксины сравнительно быстро разрушаются в организме животных, практически не накапливаются в их органах и тканях, некоторые из них в небольших количествах могут выделяться с молоком. Поэтому основной метод диагностики микотоксикозов — биологическое или химико-аналитическое исследование на содержание микотоксинов в зернофураже, грубых кормах, пораженных плесенью, а также жмыхах и шротах.

Для определения микотоксинов в кормах используют методы на основе тонкослойной (ТСХ), газожидкостной (ГЖХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В последние годы для этой цели стали широко применять методы на основе им- муноферментного анализа (ИФА).

Определение Т-2-токсина в кормах с применением иммунофер- ментного анализа. Метод разработан Г. П. Кононенко, А. А. Буркиным, Н. А. Соболевой (1996) и утвержден Департаментом ветеринарии МСХ РФ. Предназначен для количественного определения Т-2-токсина в кормовом сырье и готовых кормовых смесях, выполняется с применением иммуноферментного анализа (ИФА) и позволяет определять содержание Т-2-токсина в пробах до уровня 35 мкг/кг.

Краткая характеристика определяемого вещества.

Наиболее часто T-2-токсикоз возникает при использовании в корм животным зерна и соломы, длительное время хранившихся в валках или перезимовавших под снегом и пораженных грибами F. sporotrichioides.

Принцип. Метод состоит в извлечении T-2-токсина из размолотого образца смесью ацетонитрила и воды, очистке экстракта на колонке, заполненной сорбентом, и оценке количественного содержания T-2-токсина методом твердофазного конкурентного ИФА с определением интенсивности окрашенных комплексов с помощью фотометра с вертикальным лучом.

Реактивы: ацетонитрил (ч.); спирт этиловый; кислота серная (ч.); вода дистиллированная;

адсорбент для очистки экстрактов марки К-3 [поставщик ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии, ВНИИВСГЭ, 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5, тел.(095) 256-66-22];

Т-2-токсин;

аналитический стандарт для ИФА (поставщик ВНИИВСГЭ); диагностический набор T-2-токсин-ИФА из 8 реактивов: Т-2-АГ, Т-2-АТ, ФК, «БУФЕР-ОТ» (концентрат), «БУФЕР-Р1» (концентрат), «БУФЕР-Р2» (концентрат), «Субстрат», ФДА. Поставщик ООО «Фарматек», 119332, г. Москва, ул. Московская, д. 47; смесь для экстракции ацетонитрил-вода (425:65); рабочий раствор серной кислоты: кислота-вода (20:80); рабочий раствор из реактива «БУФЕР-ОТ» (концентрат). 57 мл воды заливают в колбу на 250 мл и добавляют 3 мл реактива «БУФЕР-ОТ» (концентрат). Колбу встряхивают, наносят маркировку «ОТ».

Оборудование: мельница МРП-1; делитель БИС-1; весы лабораторные технические типа ВЛКТ; фотометр АКИЦ-1; холодильник бытовой; планшеты полистироловые для ИФА, наборные; дозатор с регулировкой для отбора жидкостей на 0,2—1,0 мл; микродозатор для отбора жидкостей на 0,02—0,2 мл; комплект съемных наконечников; штатив лабораторный; резиновая груша № 1; фильтры бумажные с синей лентой; пипетки пастера стеклянные; колбы на 250 и 1000 мл; цилиндры мерные на 25, 100, 500 и 1000 мл; пробирки П-1-10-0,1 ХС.

Подготовка ячеек планшета.

Приготовление рабочего раствора реактива Т-2-АГ. 3,2 мл воды залить в коническую пробирку, затем туда же влить 0,8 мл реактива «БУФЕР-Р1» (концентрат), после этого в пробирку залить 0,02 мл реактива Т-2-АГ. Раствор перемешать и нанести маркировку «АГ». Во все ячейки планшета залить по 0,2 мл рабочего раствора АГ. Планшет накрыть крышкой и поместить его на 16 ч в бытовой холодильник.

Ход определения. Измельченную пробу корма массой 25 г помещают в колбу на 250 мл, заливают 125 мл смеси для экстракции, колбу встряхивают 3—4 раза круговыми движениями и выдерживают в течение 16 ч при комнатной температуре. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр с синей лентой во вторую колбу на 250 мл. Экстракт подвергают колоночной очистке. Для этого в сужающуюся часть закрепленной в штативе пипетки Пастера вкладывают вату, уплотняют ее таким образом, чтобы толщина слоя не превышала 0,3—0,5 см. Засыпают в колонку 1,0 г адсорбента К-3, слой слегка уплотняют постукиванием колонки, а затем вносят в колонку 0,5 мл экстракционной смеси. Колонка готова к работе, как только жидкость опустится до поверхности наполнителя.

Под колонку устанавливают коническую пробирку. После этого с помощью дозатора вносят в колонку 1,0 мл экстракта и продавливают его через слой адсорбента с помощью резиновой груши таким образом, чтобы скорость вытекания экстракта не превышала 1 капля/с. Как только уровень жидкости опустится до уровня поверхности наполнителя, в колонку добавляют 1,0 мл смеси для экстракции и продавливают ее через адсорбент в том же режиме.

После инкубации в холодильнике планшета с рабочим раствором «АГ» раствор сливают встряхиванием. Затем в каждую ячейку микродозатором вносят по 0,25 мл раствора «ОТ», выдерживают в течение 2 мин и сливают встряхиванием.

Приготовление рабочего раствора из реактива «БУФЕР-Р2» (концентрат). 9,6 мл дистиллированной воды заливают в коническую пробирку, добавляют 0,4 мл реактива «БУФЕР-Р2» (концентрат), перемешивают и наносят маркировку «Р2».

Приготовление рабочего раствора очищенного экстракта. Микродозатором 0,27 мл раствора Р2 вносят в коническую пробирку, добавляют 0,03 мл очищенного экстракта. Содержимое перемешивают и наносят маркировку, соответствующую номеру пробы.

Приготовление растворов из реактива Т-2-токсин, аналитический стандарт. В 3 конические пробирки микродозатором заливают 0,27, 0,12 и 0,12 мл смеси для экстракции. Затем 0,03 мл реактива Т-2-токсин, аналитический стандарт добавляют в первую пробирку, перемешивают и ставят маркировку «С1». С использованием нового наконечника 0,03 мл раствора С1 заливают во вторую пробирку, содержащую 0,12 мл смеси, перемешивают и наносят маркировку «С2». 0,03 мл смеси С2 заливают в третью пробирку и наносят маркировку «СЗ».

Приготовление рабочих растворов для калибровки. В 3 конические пробирки внести по 0,27 мл раствора Р2, по 0,03 мл растворов С1, С2 и СЗ соответственно и нанести маркировки «К1», «К2» и «КЗ» в соответствии с цифрами в маркировках вносимых растворов. В четвертую пробирку отмерить дважды по 0,27 мл раствора Р2 и залить туда же 0,03 мл смеси для экстракции, нанести маркировку «КО« и перемешать.

Заполнение ячеек с маркировкой «О» и «КО». Микродозатором в

3. ячейки, обозначенные на контуре значками «0» и «КО», внести по

0. 1 мл раствора КО, а в ячейку «0» добавить еще 0,1 мл раствора Р2.

Внесение в ячейки рабочих растворов для калибровки очищенных экстрактов. В ячейки, обозначенные на контуре значками «К-1», «К-2» и «КЗ», внести по 0,1 мл растворов К1, К2 и КЗ, в ячейки, обозначенные на контуре значками «№ пробы», — по 0,1 мл рабочих растворов очищенных экстрактов.

Приготовление рабочего раствора из реактива Т-2-АТ.

Внесение рабочего раствора АТ в ячейки. Во все ячейки, кроме одной, обозначенной на контуре значком «0», вносят по 0,1 мл раствора АТ.

Инкубация. Планшет аккуратно встряхивают, накрывают крышкой и выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре, встряхивая его вручную через каждые 10—15 мин.

Отмывка. Раствор из ячеек слить встряхиванием. Во все ячейки внести по 0,25 мл раствора ОТ, оставить на 2 мин и слить встряхиванием. Процедуру повторить еще 3 раза.

Приготовление рабочего раствора из реактива ФК. 4,0 мл раствора Р2 внести в коническую пробирку, туда же влить 0,02 мл реактива ФК (концентрат), нанести маркировку «ФК». Во все ячейки внести по 0,2 мл рабочего раствора ФК..

Инкубация и отмывка. Планшет аккуратно встряхнуть, накрыть крышкой и выдержать 1 ч при комнатной температуре, встряхивая через каждые 10—15 мин, после чего слить встряхиванием. После этого планшет отмывают раствором ОТ, как это сделано выше.

Приготовление раствора для ферментативной реакции. 3,6 мл дистиллированной воды залить в коническую пробирку, добавить в нее 0,4 мл реактива «Субстрат» (концентрат) и 0,02 мл реактива ФДА. Перемешать, нанести маркировку «субстрат».

Проведете ферментативной реакции. По 0,2 мл раствора «субстрат» внести во все ячейки. Планшет накрыть крышкой и выдержать в течение 45 мин в темноте при комнатной температуре.

Остановка реакции. Во все ячейки внести по 0,05 мл рабочего раствора серной кислоты, планшет аккуратно встряхнуть и через 10 мин приступить к измерению оптической плотности окрашенного комплекса.

Учет реакции. Планшет поместить в фотометр, навести на ячейку «0» и выставить ноль прибора. Последовательно перемещая планшет по ячейкам, измерить оптическую плотность раствора в каждой ячейке и записать результат.

% связывания = Среднее 0Птич. плотности варианта . ш Среднее оптич. плотности «КО»

По значениям процентов связывания для вариантов К1, К2, КЗ на оси ординат и соответствующим значениям десятичных логарифмов концентрации (мкг/мл) рабочих растворов Т-2-токсина для калибровки (—2,00; —2,70; —3,40) на оси абсцисс провести калибровочную прямую от 10 до 90 % связывания. По значениям процентов связывания для остальных вариантов с помощью калибровочной прямой найти значения логарифмов концентраций Т-2-токсина в рабочих растворах [(с) мкг/мл] и рассчитать его содержание в пробах по формуле

(с) мкг/кг - (с) мкг/мл • 105.

Клиническое значение. Обнаружение в кормахТ-2-ток- сина в количествах, превышающих 100 мкг/кг корма, служит основанием для постановки предварительного диагноза на Т-2-токси- коз. Однако окончательный диагноз может быть поставлен только после изучения клинической картины интоксикации и результатов патологоанатомического вскрытия. Кроме того, результаты химико-аналитического исследования целесообразно подтвердить постановкой кожной пробы на кролике. Для этого на выстриженную кожу кролика наносят концентрированные ацетоновые или эфирные экстракты из кормов. При наличии в пробах Т-2-токсина в количествах, способных вызвать клиническую картину интоксикации, через 2—3 дня после нанесения развивается резкая гиперемия, отек с утолщением кожи и последующим образованием язв.