МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ПЕСТИЦИДОВ  

В настоящее время зарегистрированы и разрешены к применению в качестве средств защиты растений и животных следующие ФОП: актеллик, пиримифосметил; антио; препараты на основе диазинона (базудин, неоцидол, диозол) и фосфамида (БИ-58, ди- метоат); байтекс; хлорофос (негувон, трихлорфон); циодрин; фоза- лон; карбофос (малатион).

Для определения ФОП в патологическом материале, кормах, препаративных формах с целью постановки диагноза на отравление наибольшее распространение получили методы на основе тонкослойной (ТСХ) и газожидкостной хроматографии (ГЖХ).

Определение ФОП методом ТСХ. Для определения ФОП методом ТСХ в качестве проявляющих реагентов используют смеси различных химических соединений, таких, как ацетоновые растворы бромфенолового синего и азотнокислого серебра с последующей обработкой пластинки лимонной кислотой; 0,7%-ный раствор

Принцип. Определение ФОП методом ТСХ с энзимным проявлением основано на их извлечении из пробы органическим растворителем, очистке осаждением на холоде, концентрировании экстракта, развитии соединения на пластинках с сорбентом и проявлении его с помощью реактива, содержащего фермент холинэс- теразу.

В основе использования энзимного проявителя лежит способность ФОП (производных фосфорной и фосфоновой кислот) подавлять в условиях in vitro активность фермента (энзима) холинэс- теразы. Степень ингибирования активности фермента определяют по уровню расщепления субстрата, в качестве которого используют индоксилацетат или броминдоксилацетат. Если в исследуемой пробе присутствует ФОП, он подавляет активность холинэстеразы, которая, в свою очередь, не расщепляет или слабо расщепляет субстрат. В результате этого на всей поверхности пластинки, где нет ФОП и активность фермента высокая, происходит расщепление субстрата и пластинка окрашивается в голубой цвет. В местах содержания ФОП на голубом фоне они выделяются в виде белых пятен.

Однако производные тио- и дитиокислот фосфора (фосфамид, байтекс, карбофос и некоторые другие) обладают слабой способностью подавлять активность холинэстеразы. Для того чтобы они обладали такой способностью, их активируют с помощью раствора брома, аммиака или путем облучения УФ-лучами. При определении в патологическом материале фосфамида или антио активацию проводят с помощью УФ-лучей, валексона, байтекса, карбофоса, метафоса — водным раствором брома; хлорофоса — водным раствором аммиака.

Реактивы: ацетон (х. ч.);

метилена хлорид (х. ч);

натрия сульфат безводный (ч. д. а.);

натрия тиосульфат, 25%-ный водный раствор;

гексан (х. ч.);

спирт этиловый ректификат; бром; индоксилацетат (ч.

калий железисто-синеродистый, 1,5%-ный водный раствор; калий железисто-синеродистый, 20%-ный водный раствор; буферный раствор, pH 8,69: 2,1 мл ортофосфорной, 2,3 мл уксусной и 2,47 г борной кислот помещают в колбу на 1 л и доводят до метки дистиллированной водой. К 100 мл указанной смеси добавляют 65 мл 0,2 н. раствора NaOH, который готовят растворением 0,8 г NaOH в 100 мл дистиллированной воды.

Ферментный препарат получают из печени крупного рогатого скота, уток или кур (свежезамороженную печень можно хранить в морозильной камере холодильника 4 мес). Для приготовления ферментного раствора 1 г печени растирают в ступке с 9 мл буферного раствора, фильтруют через вату. К 1 мл полученного гомогената добавляют 4 мл буферного раствора. Приготовленный препарат используют для опрыскивания пластинок. Применяют свежеприготовленный раствор.

Основной стандартный раствор ФОП готовят путем растворения 10 мг пестицида в 100 мл ацетона (100 мкг/мл). Из этого раствора готовят на ацетоне рабочие стандартные растворы от 0,01 до 0,5 мкг/мл.

Проявляющий реактив: 10 мг индоксилацетата или 5 мг бро- миндоксилацетата растворяют в 6 мл этанола, добавляют 10 мл дистиллированной воды, 2 мл 1,5%-ного водного раствора железис- то-синеродистого калия, 2 мл 2%-ного водного раствора железисто-синеродистого калия и хорошо перемешивают. Раствор готовят перед опрыскиванием.

Оборудование: камера для хроматографирования; камера для опрыскивания пластинок; пластинки для хроматографии «Силуфол» производства Чехии; отечественные пластинки «Армсорб» на фольге или стекле; «Плазмохром» на полимере; круглодонные и грушевидные колбы на шлифах на 25, 50 и 100 мл; пипетки на 1,5 и 10 мл; эксикаторы; воронки делительные на 250 и 500 мл; мерные колбы на 25 и 50 мл; баня водяная; вакуум-ротационный испаритель ИР-1; термостат; ступки керамические; компрессор или баллон с азотом или сжатым воздухом для распыления проявляющего реактива; пульверизаторы стеклянные; микрошприц на 100 мкл; микропипетки до 0,1 мл; шутгель-аппарат.

Ход определения. Юг измельченной ткани (печень, почки, мышцы) помещают в колбу с притертой пробкой и заливают 30 мл ацетона.

1. ч. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в другую колбу. Остаток в колбе промывают 10 мл ацетона и фильтруют через тот же фильтр. К фильтрату добавляют 40 мл дистиллированной воды, и колбу на 20 мин помещают в морозильную камеру бытового холодильника. Охлажденную смесь фильтруют через плотный ватный томпон в делительную воронку. Остаток в колбе промывают 10 мл холодной смеси ацетон-вода (1:1) и объединяют с фильтратом. Пестициды из смеси ацетон-вода реэкстрагируют в 40 мл хлороформа, встряхивая делительную воронку в течение 2 мин.

После разделения слоев нижнюю фазу фильтруют через бумажный фильтр с помещенным на него безводным натрия сульфатом в фарфоровую чашку или колбу вакуум-ротационного испарителя. Реэкстракцию повторяют. Хлороформные экстракты объединяют и упаривают досуха в токе воздуха или с помощью вакуум-ротационно- го испарителя. Сухой остаток растворяют в 5 мл этанола (В. В. Карнаухов, 1987).

На пластинки «Силуфол» или «Плазмохром» наносят не более 30 мкл раствора экстракта, подготовленного для хроматографирования. На линию старта в том же объеме наносят стандартные растворы ожидаемых ФОП концентрацией 0,5 мкг/мл, или 15 нг в пробе. Пластинки помещают в камеру для хроматографирования, в которую за 30 мин до начала разделения заливают подвижный растворитель, который необходимо предварительно подобрать, используя стандартные растворы пестицидов. Для антио и фосфами- да может быть рекомендована подвижная система бензол-ацетон (3:2). Величина ЯГ пестицидов на «Силуфоле» соответственно составит 0,8 и 0,5. Для хлорофоса система гексан-ацетон (1:1) при величине Ііґ 0,3 при определении валексона, дурсбана, карбофоса, метафоса, метилнитрофоса, фталофоса в качестве подвижного растворителя может быть использован хлороформ.

После подъема фронта растворителя на высоту 10 см пластинки вынимают и сушат при комнатной температуре. После этого проводят активацию пестицидов: пластинки опрыскивают водным раствором брома или воздействуют на них УФ-лучами.

После активации пестицидов пластинки подсушивают при комнатной температуре, опрыскивают свежеприготовленным ферментным раствором и инкубируют в термостате, насыщенном водными парами, при температуре 38 °С в течение 40—60 мин. Для насыщения термостата парами в него ставят чашку Петри, заполненную водой. После инкубации пластинку опрыскивают проявляющим раствором и снова ставят в термостат. ФОП проявляются в виде белых пятен на голубом фоне в течение 10—30 мин.

В качестве химических проявляющих реактивов при определении антио, фосфамида, фозалона и хлорофоса на пластинках «Си- луфол» наиболее целесообразно использовать раствор серебра нитрата с 2-феноксиэтанолом. Этот проявляющий реагент готовят следующим образом: в мерной колбе на 100 мл растворяют 1 г серебра нитрата в 2 мл дистиллированной воды, добавляют в колбу 10 мл 2-феноксиэтанола и доводят объем в колбе до метки ацетоном. После этого вводят 2—3 капли пероксида водорода. Пластинки сначала опрыскивают проявляющим реактивом, а затем облучают УФ-лучами, используя лампу ПРК-4. Предел обнаружения составляет для антио, фозалона и фосфамида 0,01 мкг, для хлорофоса — 0,1 мкг. При анализе дурсбана, карбофоса, метафоса и ме- тилнитрофоса наилучшие показатели достигнуты при использовании в качестве проявляющего реагента 0,7%-ного раствора 2,6-диб- ром-1Ч-хлорхинонимина в гексане или хлороформе с последующим одновременным облучением пластинки УФ- и ИК-лучами. Предел обнаружения пестицидов составляет от 0,05 до 0,1 мкг в пробе.

Количественное определение содержания пестицидов в пробе при анализе посредством ТСХ осуществляют путем сравнения площади пятен и интенсивности их окраски при анализе экстрактов и стандартных растворов. Содержание пестицида в пробе (х, мг/кг) рассчитывают по формуле

ЛЯ, V• 1000 *=-^’

где А — содержание пестицида в стандарте, мкг; — площадь пятна пробы, мм2; К — общий объем экстракта, мл; 1000 — коэффициент для пересчета на килограммы; 5( — площадь пятна стандарта, мм2; У\ — объем экстракта, нанесенного на пластинку, мкл; Р — масса пробы, взятой для анализа, г.