Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови по гидролизу ацетилхолинхлорида. 

Реактивы: 0,9 моль/л раствор ацетилхолинхлорида.

вероналовый буфер, pH 8,4. 1,5450 г натриевой соли веронала (мединала) растворяют в 500 мл дистиллированной воды, добавляют 9 мл 0,1 моль/л раствора соляной кислоты и 150 мл 0,1 г/л раствора индикатора, измеряют pH. Объем доводят дистиллированной водой до 1 л. Буфер хранят в холодильнике в посуде из темного стекла. Годен в течение 1 мес;

индикатор — фиолетовый синий с переходом окраски от желтой к красной в пределах pH 6,8—8,4. 0,1 г сухого индикатора растирают в ступке с 5,7 мл 0,05 моль/л раствора натрия гидроксида. После растворения объем доводят дистиллированной водой до

25. мл. Из полученного 0,4%-ного раствора перед употреблением готовят 0,01 %-ный раствор разведением его дистиллированной водой в 40 раз;

0,7%-ный водный раствор прозерина. 0,7 г прозерина растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Хранят в посуде из темного стекла;

0,1 моль/л раствор уксусной кислоты. Готовят из стандарт-титра (фиксанала) или путем доведения дистиллированной водой 5,7 мл ледяной уксусной кислоты (х. ч.) до 1000 мл в мерной колбе на 1 л.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; водяная баня; ультратермостат; мерные колбы.

Ход определения.

Контроль ставят так же, как опыт, но раствор прозерина добавляют до инкубации.

Из экстинкции контрольной (холостой) пробы вычитают экстинкцию опытной. Расчет ведут по калибровочному графику. Активность холинэстеразы выражают в микромолях уксусной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации или в нмоль/с • л. В этом случае полученную величину умножают на коэффициент 0,280.

Для построения калибровочного графика из 0,1 моль/л раствора уксусной кислоты готовят разведения, как указано в таблице 35.

Из каждого разведенного раствора отбирают по 0,2 мл, добавляют 5 мл вероналового буфера и 0,1 мл сыворотки, прогревают

5. мин при температуре 37 °С, добавляют 0,2 мл раствора прозерина, 0,2 мл ацетилхолинхлорида. Смесь инкубируют 30 мин при температуре 37 °С, быстро охлаждают. Экстинкцию измеряют при тех же условиях, что и в опытных пробах. Холостую пробу ставят

   35. Разведения раствора уксусной кислоты для построения калибровочного графика

так же, как калибровочную, но вместо стандартных растворов используют дистиллированную воду.

Примечания. 1. Активность холинэстеразы заметно не изменяется при хранении сыворотки в герметически закрытых пробирках в холодильнике при температуре 2—6 °С в течение 4 дней. 2. Исследование должно проводиться тотчас после доставки образцов крови в лабораторию. 3. Ложноотрицательные результаты вследствие ингибирования активности холинэстеразы дают цитраты (антикоагулянты), оксалаты, фториды. 4. Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови возможно методом с субстратом бутирилтиохолина йодидом.

Источники: 19, 43.

Клиническое значение. Холинэстераза расщепляет аце- тилхолин на холин и уксусную кислоту. Фермент синтезируется в печени, поэтому степень активности холинэстеразы во многом зависит от функционального состояния этого органа.

У здоровых животных активность холинэстеразы сыворотки крови ориентировочно составляет 150—300 мкмоль/ч ¦ мл (42—84 нмоль/с ¦ л). Уменьшение активности холинэстеразы отмечается при хроническом гепатите, циррозе печени, отравлениях фосфорорганическими средствами. Активность холинэстеразы низка у новорожденных животных.

Определение активности уреазы в сое. Реактивы: индикатор феноловый красный. В 10 мл этилового спирта растворяют 50 мг индикатора;

калия фосфат двузамещенный (К2НРО4) и калия фосфат одноза- мещенный (КН2РО4) (ч. д. а., х. ч.) перекристаллизованные;

0,05 н. раствор К2НРО4. 8,7 г вещества растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 1 л;

0,05 н. раствор КН2РО4. 6,8 г вещества растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 1 л;

мочевина (карбамид);

эталонные буферные растворы готовят в колбочках с притертыми пробками, как указано в таблице 36.

Оборудование: ступка фарфоровая; сито с отверстиями диаметром 0,25 мм; колбочки с притертыми пробками.

Ход определения. Измельчают соевый шрот или зерно сои, просеивают на сите. В каждую из семи пробирок вносят по 10 мл эталонного буферного раствора с соответствующими pH и по 2 капли раствора индикатора. В две параллельные пробирки

вносят по 0,2 г измельченного соевого шрота или соевой муки, по 10 мл буферного раствора № 1 (pH 7,00), по 0,3 г мочевины и по

2. капли раствора индикатора. Пробирки со смесью выдерживают в водяной бане при температуре 20—25 °С в течение 30 мин, периодически осторожно встряхивают. Появившуюся в пробирках окраску сравнивают с эталонной в семи буферных растворах, находят pH испытуемой пробы.

Активность уреазы определяют по формуле

х = pH, - рН0gt;

где х — активность уреазы, pH; pH, — величина pH раствора испытуемого образца; рН0 — pH исходного буферного раствора (pH 7,00).

В параллельных пробах корма допускаются расхождения pH не более ±0,05.

Клиническое значение. В соевых кормах, не подвергшихся соответствующей термической обработке, имеются ингибиторы трипсина. Поедание таких кормов птицей и свиньями вызывает расстройство пищеварения, диарею и другие нежелательные последствия. Поэтому в таких кормах перед их скармливанием определяют активность уреазы и выражают ее величиной pH. В соевой муке и шроте для птиц pH должен быть не более 0,1.