Определение активности пероксидазы (КФ 1.11.1.7) в крови. 

Принцип. Метод основан на определении скорости реакции окисления бензидина пероксидом водорода при участии фермента с образованием окрашенного продукта реакции, имеющего максимум поглощения при 520 нм.

Реактивы: 2,5 ммоль/л раствор бензидина.

0,333 н. раствор пероксида водорода: сначала готовят 0,6%-ный раствор его и концентрацию пероксида определяют титрованием 0,1 н. раствором перманганата калия. На титрование 3 мл 0,333 н. раствора Н2О2 должно пойти 10 мл 0,1 н. КМ11О4. По результатам титрования раствор Н2О2 доводят до нужной концентрации дистиллированной водой.

Оборудование: спектрофотометр с термостатируемой кюветой; ультратермостат; весы аналитические; секундомер; бюретки для титрования; пробирки химические.

Ход определения. К 0,1 мл основного гемолизата ге- паринизированной крови (приготовленный, как описано выше при определении активности каталазы) прибавляют 19,9 мл дистиллированной воды — рабочий гемолизат.

В термостатируемую кювету с ходом луча 10 нм приливают 2 мл раствора бензидина и 0,5 мл раствора пероксида водорода, предварительно подогретых до 37 °С. Содержимое кюветы перемешивают, открывают шторку камеры фотоэлемента спектрофотометра и, изменяя ширину щели, устанавливают показания спектрофотометра на нулевую отметку шкалы оптической плотности при длине волны 520 нм. В кювету добавляют 0,1 мл рабочего гемолизата, перемешивают и ровно через 1 мин (по секундомеру) снимают показатели оптической плотности опытной пробы.

Для учета изменения оптической плотности за счет неферментативного окисления бензидина аналогично опытной пробе проводят измерение оптической плотности контрольной пробы, содержащей вместо рабочего гемолизата 0,1 мл дистиллированной воды.

Расчет активности пероксидазы крови проводят по формуле

.

где А — активность фермента, ед. опт. пл/л - с; Е0 — оптическая плотность опытной пробы; Ек — оптическая плотность контрольной пробы; 16,08 • 10 — фактор разведения; 60 — время проведения реакции, с.

Примечания. 1. Поскольку метод требует определения оптической плотности реакционной смеси в строго определенный момент времени, целесообразно использовать спектрофотометр с цифровой регистрацией результатов времени. 2. Пробы гепаринизирован- ной крови можно хранить при 4 °С в течение 1 сут.

Клиническое значение. Пероксидаза в отличие от каталазы содержит одну гемовую группу на одну молекулу фермента. Она менее широко распространена в живой природе. В организме животных и человека пероксидаза содержится в слюне, соке поджелудочной железы, в тонком и толстом кишечнике, печени, почках, селезенке, легких, лейкоцитах. Как и каталаза, пероксидаза восстанавливает Н2О2 до воды и молекулярного кислорода (О2), используя в качестве доноров водорода фенолы, амины, органические кислоты. Пероксидазная активность крови обусловлена в основном ее наличием в гранулоцитах. Она адсорбируется на мембранах фагоцитированных бактерий, генерирует альдегиды, синглетный кислород, другие свободные радикалы, которые повреждают клетки. Ее активность в крови колеблется от 30 до 65 ед. опт. пл./л • с.

Источник: 11.

Определение активности глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9)

в крови. Принцип. Глутатионпероксидаза (селенсодержащий фермент), восстанавливая гидропероксиды, окисляет восстановленный глутатион (Н2О2 + в—8Н -» 2Н2О2 + в-З-З-в), по уменьшению которого в среде инкубации определяется активность фермента.

Реактивы: 0,1 моль/л фосфатный буфер, pH 7,4. Для этого 6,8 г КН2РО4 растворяют в 500 мл дистиллированной воды, 11,4 г К2НРО3 • ЗН2О в 500 мл воды и смешивают полученные растворы под контролем рН-метра до необходимого pH;

31,88 ммоль/л раствор восстановленного глутатиона.

8. ммоль/л раствор пероксида водорода. На титрование такого раствора должно идти 6,96 мл 1 н. раствора КМпОф По результатам титрования раствор пероксида водорода доводят водой до необходимой концентрации;

10 %-ный раствор трихлоруксусной кислоты: 10 г ТХУ растворяют в 90 мл дистиллированной воды;

0,3 моль/л фосфатный буфер, pH 8,0: 10,2 г КН2РО4 растворяют в 250 мл воды, 34,2 г К2НРО4 • ЗН2О в 500 мл воды, под контролем рН-метра растворы смешивают до необходимого pH;

0. ммоль/л раствор Эллмана: 39,6 мг 5,5-дитио-бис-(2-нитро- бензойной) кислоты растворяют в 10 мл абсолютного метилового спирта.

Оборудование: спектрофотометр; центрифуга рефрижераторная; баня водяная; холодильник бытовой; весы аналитические; секундомер; рН-метр; колбы мерные; пробирки химические и центрифужные; пипетки измерительные.

Ход определения. В химические пробирки наливают по 0,5 мл гепаринизированной крови и добавляют по 3,5 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают и оставляют в холодильнике на 10—15 мин для более полного гемолиза. В другие химические пробирки вносят по 1 мл раствора глутатиона и прибавляют по 1 мл гемолизата. Затем по 0,5 мл смеси переносят в две центрифужные пробирки, помещают их в водяную баню при 37 °С

и инкубируют в течение 5 мин. В первую пробирку (опытную) добавляют 0,1 мл раствора пероксида водорода, интенсивно встряхивают и оставляют в водяной бане. Ровно через 1 мин после этого (по секундомеру) в опытные и контрольные пробы приливают по 2 мл холодного 10%-ного раствора ТХУ. В контрольные пробирки только после этого добавляют 0,1 мл раствора Н2О2.

Обе пробирки встряхивают и помещают на 10 мин в холодильник. Затем пробирки центрифугируют при 3000 мин 1 и 0—4 °С в течение 15 мин. По 0,5 мл надосадочной жидкости из опытной и контрольной пробирок переносят в химические пробирки и приливают в них по 10 мл фосфатного буфера, pH 8,0. В обе пробирки прибавляют по 0,05 мл реактива Эллмана, содержимое тщательно перемешивают.

Измеряют оптическую плотность контрольной пробы по сравнению с опытной в кювете с ходом луча 10 мм при 412 нм.

Для определения скорости неферментативного окисления восстановленного глутатиона исследуют пробы, в которые вместо гемолизата прибавляют 1 мл воды (далее как описано выше) (см. с. 177).

Расчет активности глутатионпероксидазы крови проводят по формуле

_ (?о-?к)-10.55-1°6- 166,4 13100

где А — активность фермента, МЕ [мкмоль восстановленного глутатиона/л • мин]; Е0 — оптическая плотность контрольной пробы по сравнению с опытной при неферментативном окислении глутатиона; Ек — оптическая плотность контрольной пробы по сравнению с опытной при неферментативном окислении глутатиона; 10,55 — конечный объем пробы; Ю6 — пересчет в мкмоли; 166,4 — фактор разведения; 13 100 — коэффициент малярной экстинкции тионитрофенильного аниона (ТНФА), образующегося после окисления 5,5-дитио-бис-(2-нитробензойной) кислоты, входящего в состав раствора Эллмана.

Примечания. 1. Исследование необходимо проводить возможно быстрее после взятия крови. 2. Реактив Эллмана необходимо приливать к буферу после внесения в него супернатионата как можно быстрее.

Клиническое значение. Глутатионпероксидазе принадлежит ведущее место в ферментативном звене антиоксидантной защиты организма. Она катализирует превращение пероксида водорода и органических пероксидов до гидросоединений, которые в дальнейшем могут метаболизироваться клеточными системами. В одной молекуле фермента содержится четыре атома селена. В организме животных обнаружена глутатионпероксидаза (ГПО-2), не содержащая селена, которая имеет субстратное родство только к органическим пероксидам. Селенсодержащая глутатионпероксидаза (ГПО-1) предотвращает продолжение процесса ПОЛ, обезвреживая уже образовавшиеся гидропероксиды жирных кислот, и одновременно предупреждает их образование. Под ее влиянием восстановленный глутатион реагирует с пероксидом водорода и превращается в окисленный, который при участии фермента глутатионредуктазы вновь переходит в восстановленный. Активность глутатионпероксидазы зависит не только от интенсивности процесса ПОЛ, но и от обеспеченности организма селеном: нормально сбалансированные по селену рационы поддерживают активность фермента на стабильно высоком уровне. Недостаток, наоборот, снижает его активность. В среднем активность глутатионпероксидазы в крови животных колеблется от 8 до 20 мкмоль

О-БН/л • мин • 103.

Источники'. 11,41.