Определение меди и железа в крови по Сенделу в модификации С. Г. Кузнецова. 

Реактивы: 0,5 моль/л раствор хлористоводородной кислоты;

2. моль/л раствор хлористоводородной кислоты;

10%-ный раствор аммиака;

0,1%-ный водный раствор и-нитрофенола (ЫОгСбЩОН);

1%-ный раствор аскорбиновой кислоты;

1%-ный раствор солянокислого о-фенантролина.

0,1%-ный раствор фенолфталеина;

0,1 моль/л ацетатный буфер, pH 4. В мерной колбе на 1 л растворяют 13,608 г натрия ацетата (СНзСОСЖа • ЗН2О, х. ч.), приливают 25 мл ледяной уксусной кислоты (х. ч.) и доводят объем дистиллированной водой до метки. Далее буфер фильтруют и определяют pH. Хранят при температуре 4 °С;

0,01%-ный раствор дифинилкарбазона в бензоле. 10 мг реактива переносят в мерную колбу на 100 мл, добавляют 40—50 мл бензола (х. ч.) и нагревают в стакане с горячей водой до растворения реактива. Колбу охлаждают и доводят объем бензолом до метки. Раствор хранят в темной склянке 2 нед;

основной калибровочный раствор железа (100 мкг/мл). 0,8634 г железоаммонийных квасцов [(ЫЩРе^О^ • 12Н2О, х. ч.] растворяют в 1 л бидистиллированной воды, подкисленной 5 мл концентрированной серной кислоты. Для построения калибровочной кривой готовят рабочие растворы, содержащие от 1 до 5 мкг железа в 1 мл. Пробы должны содержать от 0,5 до 20 мкг железа;

основной калибровочный раствор меди (100 мкг/мл). 0,3928 г свежеперекристаллизованной меди сульфата (Си804 • 5Н20) растворяют в 1 л бидистиллированной воды, подкисляют 5 мл концентрированной серной кислоты. Для построения калибровочной кривой готовят рабочий раствор, содержащий 2 мкг меди в 1 мл (2 мл основного раствора в 100 мл).

Оборудование: фотоэлектроколориметр; тигли фарфоровые; муфельная печь; электроплитка; пробирки с притертыми пробками.

Ход определения. В фарфоровый тигель вносят 2 мл крови для определения меди или 2 мл сыворотки для определения железа, сжигают в муфельной печи при температуре 550—600 °С в течение 5—7 ч. Если озоления полностью не произошло, то тигель охлаждают, добавляют 1 мл 50%-ного раствора азотной кислоты, осторожно выпаривают на электроплитке и снова помещают в муфельную печь на 1—2 ч. В тигель приливают 5—6 мл 2 моль/л раствора хлористоводородной кислоты, доводят до кипения, а затем переносят в пробирку с меткой на 10 мл. Тигель споласкивают бидистиллированной водой, сливают содержимое в пробирку и доводят объем до метки.

Определение меди. 5 мл раствора золы вносят в пробирку с притертой пробкой, прибавляют 1 каплю 0,1%-ного раствора фенолфталеина, добавляют по каплям 10%-ный раствор аммиака до появления светло-розовой окраски. В случае перетитрования вносят по каплям 2 моль/л раствор соляной кислоты до получения нужной окраски. Для точного установления pH прибавляют 1 мл ацетатного буфера. Розовая окраска исчезает. Затем в пробирку вносят 5 мл (из бюретки на 50 мл) 0,01 %-ного раствора дифинилкар- базона и встряхивают в течение 1 мин. После расслоения верхний слой приобретает красную окраску, интенсивность которой пропорциональна количеству меди в пробе.

Оптическую плотность верхнего слоя измеряют на ФЭКе при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против контроля.

Определение железа. 2,5 мл раствора золы вносят в пробирку с меткой на 5 мл, добавляют 1 каплю 0,1%-ного раствора «-нитрофенола и нейтрализуют 10%-ным раствором аммиака до появления желтой окраски. Добавляют по каплям 0,5 н. раствор хлористоводородной кислоты до исчезновения окраски. Затем вносят 5 капель 1 %-ного раствора аскорбиновой кислоты, перемешивают и через 10 мин добавляют 5 капель 1%-ного раствора солянокислого о-фенантролина. Доводят объем бидистиллированной водой до метки, перемешивают. Измеряют на ФЭКе при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против контроля. Окраска устойчива в течение суток.

Расчет ведут по формуле

АУ ¦ 100 С ’

где х — количество меди (или железа), мкг%; А — количество меди (или железа) по калибровочной кривой, мкг; V — объем раствора золы, мл (для меди 10 мл, для железа 5 мл); С — количество раствора, взятого на анализ, мл; 100 — коэффициент для пересчета в мкг%.

Источники: 42, 52.

Клиническое значение. Медь непосредственно участвует в гемопоэзе, катализирует включение железа в структуру гена, способствует созреванию эритроцитов, является остеогенным элементом, входит в состав медьсодержащего белка — церулоплазми- на. Она является составной частью цитохромоксидазы, тирозина- зы, уреазы и многих других ферментов. При недостатке ее развивается анемия, нарушается пигментация и кератинизация шерсти и пера, наступает дистрофия костей и суставов, снижаются продуктивность и репродуктивная функция. Такие явления сопровождаются снижением меди в крови (норму см. в приложениях 4 и 5).

Избыточное поступление меди ведет к накоплению ее в печени и почках, развивается токсикоз. В этих случаях можно обнаружить повышение концентрации меди в крови.

В целях диагностики различных заболеваний используют показатели активности десятков ферментов и их изоферментов. В клинической практике часто определяют активность аспартатаминотранс- феразы (АсАТ), аланинаминотрансферазы (АлАТ), лактатдегидроге- назы (ЛДГ), щелочной фосфатазы (ЩФ), глутаматдегидрогеназы (ГлДГ), аргиназы, уракиназы, гистидазы, алкогольдегидрогеназы, ци- тохромоксидазы, амилазы, сорбитолдегидрогеназы и многих других.

Определение активности АсАТ и АлАТ в сыворотке крови динит- рофенилгидрозоновым методом (Рейтмана—Френкеля).

Реактивы: 0,1 моль/л фосфатный буфер, pH 7,4. 14,2 г натрия форфата двузамещенного (1Ча2НР04 • 2Н2О) и 13,6 г калия фосфата однозамещенного (КН2РО4) доводят каждый в отдельности до 1 л дистиллированной водой. Натрий фосфат двузамещенный, содержащий две молекулы воды, получают путем двухсуточного выветривания на воздухе кристаллической соли (х. ч.), содержащей обычно 12 молекул воды. Соль предварительно растирают в ступке в порошок. Для получения буферного раствора pH 7,4 смешивают 840 мл 0,1 моль/л раствора Ма2НР04 • 2Н20 и 160 мл 0,1 моль/л раствора КН2РО4. Величину pH буфера доводят под контролем рН-метра. Полученный раствор с индикатором бромтимоловым синим должен давать голубую окраску. К приготовленному раствору в качестве консерванта можно добавить 5—10 мл хлороформа;

0,04%-ный раствор бромтимолового синего. 100 мг индикатора растирают в ступке с 3,2 мл 0,05 моль/л раствором натрия гидроксида. После растворения смывают водой в мерную колбу на 250 мл и доводят объем водой до метки;

субстратный раствор для определения аспартатаминотрансфе- разы. 29,2 мг а-кетоглютаровой кислоты и 2,66 г ОЬ-аспарагино- вой кислоты (или 1,33 г Ь-аспарагиновой кислоты) отвешивают на аналитических весах и растворяют в 1 моль/л раствора натрия гидроксида, который следует прибавлять осторожно, небольшими порциями до полного растворения составных частей и до получения pH 7,4. Раствор приливают количественно в мерную колбу на 100 мл, ополаскивая 0,1 моль/л фосфатным буфером, pH 7,4. Доливают буфер в колбу до метки, тщательно перемешивают, прибавляют 1 каплю хлороформа и сохраняют в холодильнике в замороженном виде.

субстратный раствор для определения аланинаминотрансфера- зы. 29,2 мг а-кетоглютаминовой кислоты и 1,78 г ОЬ-аланина (или 0,89 г Ь-аланина) отвешивают на аналитических весах. Дальнейшая работа, как и с предыдущим реактивом;

раствор 2,4-динитрофенилгидрозина. 19,8 мг реактива растирают в небольшом количестве 1 моль/л раствора соляной кислоты при нагревании на водяной бане. После того как раствор остынет, доводят объем соляной кислотой до 100 мл. На следующий день реактив фильтруют. Раствор хранят в посуде из темного стекла в холодильнике. Годен в течение 1 года;

0,4 моль/л раствор натрия гидроксида, свободный от карбонатов. Бутыли с реактивом и дистиллированной водой закрывают пробками с поглотительными трубками, наполненными натронной известью или бария гидроксидом;

калибровочный раствор натрия пирувата (СНзСОСОСЖа).

11. мг кристаллического натрия пирувата (белого цвета) растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят объем до метки водой. 1 мл раствора содержит 110 мкг натрия пирувата, что соответствует 88 мкг пировиноградной кислоты.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; весы аналитические; термостат.

Ход определения АсАТ. В пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора для определения АсАТ, нагревают при температуре 37 °С в течение 5 мин, добавляют 0,1 мл сыворотки и инкубируют при 37 °С 60 мин. Затем добавляют 0,5 мл 2,4-динитрофе- нилгидрозинового раствора и выдерживают в течение 20 мин при комнатной температуре. Добавляют 5 мл 0,4 моль/л натрия гидроксида, тщательно перемешивают и оставляют для развития окраски на 10 мин при комнатной температуре. Измеряют на ФЭКе при 500—560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы.

Холостую пробу ставят, как опыт, но сыворотку добавляют после инкубации.

Ход определения АлАТ.

Расчет активности ферментов в сыворотке крови проводят по калибровочному графику.

Из калибровочного раствора готовят ряд разведений, как указано в таблице 32.

Калибровочные пробы ставят так же, как опытные, но вместо сыворотки добавляют разведенные калибровочные растворы. Из-

меряют против холостой пробы, в которую вместо калибровочного раствора добавляют воду. Калибровочная кривая линейна до величины экстинкции 0,3.

Источник: 43.

Примечание. Метод Райтмана—Френкеля положен в основу заводских наборов реактивов для определения активности АсАТ и АлАТ, выпускаемых ЧНПП «Фи- лист-диагностика» (Украина), фирмой «Ла-Хема» (Чехия) и др. Исследование активности ферментов в сыворотке или плазме должно быть проведено в день взятия крови.

Клиническое значение. Аминотрансферазы переносят аминогруппы от аминокислот к кетокислотам. АсАТ и АлАТ не обладают органной специфичностью, однако определение их активности используют для диагностики болезней печени и сердца.

При гепатитах резко повышается активность АлАТ, поражение миокарда сопровождается преимущественно возрастанием активности АсАТ. Нами (И. П. Кондрахин) отмечено резкое повышение активности АсАТ и АлАТ при травматическом перикардите у коров. У здоровых животных активность АсАТ составляет 0,1—0,55 микромолей пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации при 37 °С, или 28—154 нмоль/с • л. Активность АлАТ в норме составляет 0,1—0,48 микромолей пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации при 37 °С, или 28—134 нмоль/с • л.

При синдроме цитолиза гепатоцитов в несколько раз повышается активность не только АлАТ, но и АсАТ. Активность этих ферментов в сыворотке крови определяют главным образом для диагностики болезней печени и сердца, при которых происходит распад клеток.

Определение активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови по реакции с 2,4-динитрофенилгидрозином (метод Севела—Товаре- ка). Принцип. Ь-лактат под действием фермента сыворотки в присутствии никотинамид-аденин-динуклеотида (НАД) окисляется в пируват, который определяется по цветной реакции с 2,4-ди- нитрофенилгидрозином.

Реактивы: 0,45 моль/л раствор натрия лактата. В мерную колбу на 100 мл вносят 5 мл 80%-ной молочной кислоты (коммерческой), добавляют 2 моль/л раствор натрия гидроксида (ч. д. а., х. ч.) до получения pH 7,5 и доводят объем дистиллированной водой до метки. Хранят в посуде из темного стекла в холодильнике;

0,03 моль/л раствор натрия пирофосфата, pH 8,8. 6,69 г натрия пирофосфата (Г^РгС^ • ЮН2О, ч. д. а.) растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, добавляют 1 моль/л раствор соляной кислоты до получения pH 8,8 и доводят объем дистиллированной водой до 500 мл. Стабилен 1 мес при хранении в холодильнике;

раствор НДЦ. Готовят из расчета 3 мг НДЦ на 1 мл дистиллированной воды. Раствор стабилен 1 мес при хранении в холодильнике;

раствор 2,4-динитрофенилгидрозина. 19,8 мг реактива растворяют в небольшом количестве 1 моль/л соляной кислоты при нагревании в водяной бане. После охлаждения доводят объем 1 моль/л раствором соляной кислоты до 100 мл. На следующий день реактив фильтруют. Раствор хранят в посуде из темного стекла. Стабилен в течение 1 года;

0,4 моль/л раствор натрия гидроксида;

1. моль/л раствор соляной кислоты;

калибровочный раствор пировиноградной кислоты. 11 мг кристаллического натрия пирувата растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды, переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят объем до метки бидистиллированной водой. 1,0 мл раствора содержит 88 мкг пировиноградной кислоты;

рабочий калибровочный раствор готовят разведением основного раствора в 10 раз бидистиллированной водой. 1 мл рабочего раствора содержит 8,8 мкг пировиноградной кислоты.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; термостат; колбы мерные.

Ход определения. 0,1 мл сыворотки, разведенной 1:2, смешивают с 0,3 мл раствора НАД, прогревают 5 мин при 37 °С, добавляют 0,8 мл 0,03 моль/л раствора натрия пирофосфата и 0,2 мл 0,45 моль/л раствора натрия лактата, предварительно прогретых при 37 °С, и инкубируют смесь при 37 °С в течение 15 мин.

Тотчас же после инкубации добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидрозина, выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл 0,4 моль/л раствора натрия гидроксида, перемешивают. Через 10 мин измеряют экс- тинкцию раствора на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы.

Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.

Расчет активности проводят по калибровочному графику. Активность лактатдегидрогеназы выражают в микромолях пировиноградной кислоты, образовавшейся при инкубации 1 мл сыворотки в течение 1 ч при 37 °С, или нмоль/с • л.

Построение калибровочного графика. Из рабочего калибровочного раствора натрия пирувата готовят ряд разведений, как указано в таблице 33.

33. Разведения натрия пирувата для построения калибровочного графика

Затем в пробирки приливают по 0,5 мл раствора 2,4-динитро- фенилгидрозина. Далее калибровочные пробы обрабатывают и измеряют, как опытные. Холостую пробу ставят так же, как калибровочную, но вместо калибровочного раствора добавляют дистиллированную воду. Пересчет активности ЛДГ на микромоли пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации при 37 °С проводят по формуле

*= С-30 -4/88,

где х — активность ЛДГ, нмоль/с • л; С — микрограммы пировиноградной кислоты в калибровочной пробе; 30 — коэффициент пересчета на I мл сыворотки; 4 — коэффициент пересчета на 1 ч инкубации; 88 — масса 1 мкмоля пировиноградной кислоты, мкг.

Прямолинейная зависимость между концентрацией пировиноградной кислоты и оптической плотности сохраняется от 0 до 10 ммоль ч/мл. Линейная зависимость между концентрацией натрия пирувата и оптической плотностью сохраняется от 0 до 3000 нмоль/с • л.

Примечания. 1. Сыворотка крови должна быть свободной от гемолиза. 2. Для исследования рекомендуется использовать свежую сыворотку. 3. В качестве антикоагулянта не следует использовать соли щавелевой кислоты, так как они ингибируют фермент. 4. В сыворотке активность ЛДГ на 40 % выше, чем в плазме. 5. Сыворотку хранят при комнатной температуре не более 7 дней в закрытых пробирках.

Хранение сыворотки при температуре от +4 до —20 °С делает ее непригодной для анализа.

Разделение изоферментов ЛДГ проводят электрофоретическим методом на пленках из ацетата целлюлозы.

Источник: 29.

Клиническое значение. ЛДГ ускоряет реакцию окисления молочной кислоты в пировиноградную. Нормальная величина ЛДГ от 0,6 до 4,5 микромолей пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации при 37 °С, или 160—1200 нмоль/с-л. Повышение активности ЛДГ отмечают при поражении миокарда, печени и почек, причем при болезнях сердца преимущественно повышается активность изоферментов ЛДГ] и ЛДГ2, а при паренхиматозных гепатитах и нефритах — изофермента ЛДГ5. У новорожденных животных активность ЛДГ выше, чем у взрослых.

Незначительное повышение активности ЛДГ отмечают при анемиях, физиологическом напряжении, отравлениях, тиреотоксикозе, злокачественных опухолях. Все заболевания, при которых отмечается некроз тканей, сопровождаются повышением активности ЛДГ. Увеличение активности изофермента ЛДГ] характерно для поражения сердца. При болезнях печени преимущественно увеличивается активность изоферментов ЛДГ5 и ЛДГ4 и уменьшается активность ЛДГ [ и ЛДГ2.