Определение активности катал азы (КФ 1.11.1.6) в крови.
Реактивы: 0,04412 н.
раствор пероксида водорода. Готовят примерно 0,08%-ный раствор Н202 и устанавливают точную концентрацию титрованием 0,01 н. раствором КМпОф На титрование- мл 0,04412 н. раствора Н202 должно пойти 22,06 мл 0,01 н. раствора КМп04. По результатам титрования раствор Н202 доводят до нужной концентрации дистиллированной водой;
4,5%-ный раствор аммония молибденовокислого. 4,5 г молиб- дата аммония растворяют в 95,5 мл дистиллированной воды;
0,1 моль/л трис-НС1-буфер, pH 7,4;
буферно-субстратная смесь: 10 мл трис-НС1-буфера смешивают с 30 мл 0,04412 н. раствора Н202.
Оборудование: спектрофотометр; баня водяная; весы аналитические; секундомер; бюретки; пипетки с делениями; пробирки химические.
Ход определения. К0,5мл гепаринизированной крови приливают 3,5 мл дистиллированной воды, хорошо перемешивают и оставляют на 5—10 мин при комнатной температуре — основной гемолизат. К 0,2 мл основного гемолизата прибавляют 3,8 мл воды и тщательно перемешивают — рабочий гемолизат. В две химические пробирки наливают по 2 мл буферно-субстратной смеси и выдерживают в водяной бане при 37 °С в течение 10 мин. В одну из пробирок (опытную) добавляют 0,1 мл рабочего гемолизата, тщательно перемешивают и инкубируют в водяной бане при 37 °С в течение 3 мин (по секундомеру). Реакцию останавливают добавлением в опытную пробу сначала 2 мл молибдата аммония, а затем 0,1 мл рабочего гемолизата.
Измеряют оптическую плотность опытной и контрольной проб при 410 нм в кювете с ходом луча 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь, состоящую из 1 мл буфера, 3 мл дистиллированной воды и 0,1 мл рабочего гемолизата.
Активность каталазы рассчитывают по формуле
л- (?к-?о„М,11б105106
22,2 • 106 • 3
где А — активность фермента, МЕ (мкмоль пероксида водорода/л ¦ мин); Ек — оптическая плотность контрольной пробы; Еоп — оптическая плотность опытной пробы; 4,1 — конечный объем пробы; 16 • 105 — фактор разведения; 10 — коэффициент пересчета в мкмоль/л; 22,2 -106 — коэффициент малярной экстинкции Н2Сgt;2; 3 — время инкубации, мин.
Примечание. Пробы гепаринизированной крови можно хранить при 4 °С в течение 1 сут.
Клиническое значение.
Каталаза — гемсодержащий фермент, встречаемый во всех тканях, где происходят процессы клеточного дыхания с участием цитохромов, т. е. где возможно образование пероксида водорода — весьма токсичного для клеток соединения, которое должно быть удалено. Каталаза содержит четыре гемовых группы на одну молекулу фермента. Наибольшая активность фермента обнаружена в печени, эритроцитах и почках. Она с высокой степенью эффективности разлагает пероксид водорода на воду и молекулярный кислород: 2Н202 -» 2Н20 + 02. Каталаза — наиболее активный из известных фермент окислительно-восстановительной системы. Одна молекула ее способна разложить 44 000 молекул пероксида водорода в 1 с. Функция фермента — предотвращение накопления в клетках Н202, образующегося, в частности, при дисмутации супероксидного аниона. Активность данного фермента возрастает всегда, когда активизируются процессы ПОЛ в организме и возрастает концентрация Н202 в клетках.В норме активность каталазы в крови животных колеблется от 20 до 60, в том числе у кур от 40 до 60 мкмоль Н202/л • мин • 10.
Источники: 11, 77.
Еще по теме Определение активности катал азы (КФ 1.11.1.6) в крови. :
- Определение активности пероксидазы (КФ 1.11.1.7) в крови.
- Определение активности глутатионредуктазы (КФ 1.6.4.2) в крови.
- Определение антиокислительной активности (АОА) плазмы крови.
- Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови по гидролизу ацетилхолинхлорида.
- Определение активности у-глутамилтранспептидазы (у-глута- милтрансферазы) в сыворотке крови с помощью набора реактивов.
- Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по гидролизу р-глицерофосфата (метод Бодански).
- Определение активности креатинкииазы (КК) в сыворотке (плазме) крови с использованием креатинфосфата в качестве субстрата.
- Определение активности сорбитолдещдрогеназы (СДГ) в сыворотке крови по реакции с резорцином (метод Севела—Товарека).
- Определение активности а-амилазы в сыворотке крови, моче, дуоденальном содержимом амилоклассическим методом со стойким крахмальным субстратом (метод Каравея).
- Определение витамина Е в сыворотке крови (см. с. 195). Определение церулоплазмина в сыворотке крови.
- Определение активности а-амилазы.
- Определение общего рибофлавина в крови.
- Определение восстановленного глутатиона в крови.
- Определение малонового диальдепща в крови.
- ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ УРЕАЗЫ В ЖМЫХАХ И ШРОТАХ (ГОСТ 13979.9-69)[3]
- Определение белковых фракций в сыворотке крови.
- Определение витамина С в плазме крови.
- ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ МИКРОФЛОРЫ РУБЦА
- Определение марганца в крови перйодатным методом.
- ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗЕРВНОЙ ЩЕЛОЧНОСТИ КРОВИ ДИФФУЗНЫМ МЕТОДОМ ПО И. П. КОНДРАХИНУ