Определение восстановленного глутатиона в крови.  

Реактивы: 20%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ);

0,3 моль/л фосфатный буфер, pH 8,0: 10,2 г КН7РО4 растворяют в 250 мл дистиллированной воды и 34,2 г К2НРО4 • ЗН20 — в 500 мл дистиллированной воды.

0. моль/л раствор реактива Эллмана: 39,6 мг 5,5-ди- тио-бис-(2-нитробензойной) кислоты растворяют в 10 мл абсолютного метилового спирта.

Оборудование: спектрофотометр; центрифуга рефрижераторная; весы аналитические; холодильник бытовой; пипетки измерительные; пробирки центрифужные и химические.

Ход определения. В химические пробирки наливают по 0,5 мл гепаринизированной крови, 3,5 мл дистиллированной воды и хорошо перемешивают для лучшего гемолиза. Затем по 2 мл разведенной в 8 раз крови переносят в центрифужные пробирки и приливают к ним по 1 мл 20%-ного раствора ТХУ. Пробы тщательно перемешивают и оставляют в холодильнике на 15—20 мин. Затем их центрифугируют 15 мин при 3000 мин 1 и температуре 0—4 °С.

В две химические пробирки наливают по 0,5 мл фосфатного буфера и в каждую добавляют по 1 мл надосадочной жидкости. В опытную пробирку приливают 0,05 мл раствора Эллмана, а в контрольную — 0,05 мл метанола. Содержимое пробирок хорошо перемешивают. Измеряют оптическую плотность обеих проб против фосфатного буфера в 10-миллиметровой кювете при длине волны 412 нм.

Концентрацию восстановленного глутатиона рассчитывают по формуле

-              .72,6-Ю3,

13,1-Ю3

где С — содержание восстановленного глутатиона, ммоль/л; Е0 — оптическая плотность опытной пробы; Ек — оптическая плотность контрольной пробы; 13,1 • 103 — коэффициент малярной экстинкции ТНФА при 412 нм; 72,6 • 103 — фактор разведения.

Примечания. 1.

Клиническое значение. Глутатион представляет собой серосодержащий триплет, состоящий из трех аминокислот — глутаминовой, цистина и глицина. Содержится во всех живых организмах и играет важную роль в окислительно-восстановительных реакциях. В организме он присутствует главным образом в восстановленной форме (в-БН), тогда как на долю окисленной формы (в-БЗ-в) приходится 1—3 % общего его содержания. Глутатион — главный фонд мобильных сульфгидрильных групп, а также он участвует в транспорте аминокислот, обмене дисульфидов и поддержании сульфгидрильных групп белков в восстановленном состоянии. Как серосодержащее соединение глутатион участвует в реакции с гидропероксидами без участия каких-либо ферментов или катализаторов. Может ингибировать ПОЛ на уровне инициирования цепного процесса и способен реагировать со свободными радикалами так же активно, как а-токоферол.

Содержание восстановленного глутатиона в крови животных колеблется от 0,4 до 0,7 ммоль/л, в том числе у кур от 0,6 до 0,8 ммоль/л. На уровень глутатиона в крови влияет обеспеченность животных серосодержащими аминокислотами и серой. Его повышение в крови свидетельствует о выраженной защитной и детоксирую- щей силе организма.

Источники: 11, 17.