Определение малонового диальдепща в крови.  

Реактивы: 10%-ный водный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ);

0,8%-ный раствор 2-тиобарбитуровой кислоты (2-ТБК) на дистиллированной воде.

Оборудование: спектрофотометр или ФЭК; центрифуга лабораторная (лучше рефрижераторная); баня водяная; весы аналитические; пробирки химические и центрифужные; колбы мерные; пипетки с делениями разные.

Ход определения. К 2,5 мл гепаринизированной крови, внесенной в центрифужную пробирку, добавляют 2,5 мл раствора ТХУ, хорошо перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют при 3000 мин 1 в течение 15 мин и оставляют стоять на холоде 15 мин до образования крупных хлопьев. 3 мл надосадочной жидкости переносят в чистую центрифужную пробирку, прибавляют 1,5 мл раствора 2-ТБК и хорошо перемешивают. Затем пробы помещают в кипящую водяную баню на 15 мин (точно!). В ходе реакции развивается розовое окрашивание. Пробы вынимают из водяной бани, охлаждают под струей холодной воды и центрифугируют в течение 5 мин при 3000 мин \

Одновременно с опытными готовят контрольную пробу, куда вместо крови вносят 2,5 мл воды. Все остальные операции проводят как и с опытными пробами.

Полученный центрифугат осторожно, не встряхивая, переносят в химические пробирки и измеряют оптическую плотность опытных проб против контрольной при длине волны 532 нм в кювете с расстоянием между рабочими гранями 1 см.

Расчет содержания малонового диальдегида (продуктов пе- реокисления) ведут по формуле

г= Е• 106-3 1,56 105’

где С — концентрация МДА, мкмоль/л; Е — оптическая плотность пробы; 106 — коэффициент пересчета в мкмоль/л; 3 — фактор разведения; 1,56 • 105 — коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса МДА с 2-ТБК.

Примечание.

Клиническое значение. Активность свободнорадикального окисления липидов оценивают по накоплению липидных перекисей, которые определяют в форме малонового диальдегида (МДА). Повышение его концентрации свидетельствует об активизации процессов ПОЛ или о снижении антиоксидантной защиты организма. Это вызывается как эндогенными, так и экзогенными факторами, указанными выше.

Пониженная и стабильная концентрация продуктов ПОЛ, наоборот, свойственна здоровому организму с хорошо функционирующей антиоксидантной защитой. Концентрация МДА у млекопитающих животных колеблется от 0,20 до 1,5, а у кур до 1,50—2,50 мкмоль/л крови.

Источники'. 11, 18.

Определение флуоресцирующих оснований Шиффа. Принцип. Диальдегиды и ряд других конечных продуктов ПОЛ, взаимодействуя с Ы-концевыми остатками аминокислот, белков и аминогрупп фосфолипидов, образуют конъюгированные флуоресцирующие соединения типа оснований Шиффа. Эти соединения, представляющие собой комплексы липопротеидов, входящих в состав известного внутриклеточного образования — липофусцина («пигмента старения»), обладают выраженной стабильностью, медленной утилизацией и способностью накапливаться в организме. Флуоресцирующая способность его по сравнению с содержанием малонового диальдегида в 10—100 раз чувствительнее и не зависит от степени окисляемости системы. Соединения типа оснований Шиффа обладают высокой реактивной способностью и токсичностью, производя межмолекуляр- ные «сшивки» и нарушения структур и функции биомембран.

Метод определения основан на измерении флуоресценций соединений типа оснований Шиффа, извлекаемых липидными растворителями из биологических материалов.

Реактивы: хлороформ; спирт метиловый; экстрагирующая смесь (ЭС); хлороформ-метанол 2 : 1 (об/об.); 0,1 н.

Оборудование: спектроколориметр «Спекол-10» с приставкой для измерения флуоресценции или спектрофотометр любой модели; весы аналитические; холодильник бытовой; центрифуга лабораторная; баня водяная; колбы мерные; пробирки химические и центрифужные; пипетки разного объема.

Ход определения. В центрифужные пробирки вносят по 1 мл сыворотки крови, приливают по 4 мл экстрагирующей смеси и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Пробирки плотно закрывают корковыми пробками, помещают в водяную баню на 5 мин при температуре 30 °С, вынимают из бани и тщательно встряхивают в течение 1_мин. Затем пробы центрифугируют в течение 15 мин при 3000 мин . Водный слой осторожно отсасывают. Белковый слой протыкают стеклянной палочкой и нижний хлороформный экстракт липидов фильтруют в чистые пробирки через смоченный хлороформом бумажный фильтр. Измеряют флуоресценцию экстрактов при длине волны возбуждения 435—440 нм. Флуоресценцию стандартного раствора измеряют после его разведения в 1000 раз, до концентрации 1 мкг/л. Измеряют также флуоресценцию чистого хлороформа.

Расчет содержания флуоресцирующих оснований Шиффа ведут по формуле где А — содержание оснований Шиффа, относительных единиц на 1 мл сыворотки; Е0 — флуоресценция опытной пробы; — флуоресценция стандартного раствора хинин-сульфата, принятая за 1 ед.; — флуоресценция чистого хлороформа.

Примечания. 1. Сыворотку для анализа можно хранить в холодильнике не более 1 сут. 2. Хлороформ перед использованием очищают перегонкой.

Клиническое значение. Концентрация в сыворотке крови животных флуоресцирующих оснований Шиффа колеблется от 0,10 до 0,30, в том числе у кур от 0,30 до 0,60 отн. ед/мл сыворотки. Активизация процессов ПОЛ, вызываемых различными эндогенными и экзогенными факторами, указанными выше, сопровождается увеличением концентрации соединений типа оснований Шиффа.

Источник: 11.